赵东波 王昊 黄樱 巩萱 卢浩

1珠海市人民医院（暨南大学附属珠海医院）内分泌代谢科，珠海 519000；2暨南大学第一临床医学院重症医学科，广州 510000

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是临床常见疾病，患者以脂肪变性和肝实质细胞脂质过量累积为主要临床特征［1］。流行病学研究发现，全球成人NAFLD 发病率超过24%，国内患病率15%～40%［2］。肝脏脂肪代谢功能障碍诱发肝脏脂质沉积被证实是NAFLD 发生及病情进行性发展的重要病理机制，其中三酰甘油（TG）在肝细胞内的过表达是NAFLD 的重要基础病理。然而，现阶段NAFLD 具体分子机制尚未完全阐明，现代医学仍缺乏特异性治疗手段。故进一步探寻疾病潜在病理机制和靶向干预方法意义重大。单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）是与机体糖脂代谢密切相关的蛋白激酶。多项证据表明，AMPK 信号通路的异常表达是NAFLD 肝脏脂质沉积的重要潜在靶点［3］。虎杖苷（PD）是非黄酮、多酚类植物抗毒素，已被证实在抗心血管疾病、诱导细胞凋亡、抗氧化和抗炎中扮演重要角色。新近研究证实，PD 可通过靶向介导AMPK 信号通路的激活改善胰岛素HepG2 细胞的脂质代谢［4］。然而，PD 是否可通过靶向介导AMPK 信号通路的表达改善NAFLD 患者肝脏脂质沉积仍未见系统报道。基于此背景，2021 年1 月至6 月，本次研究通过构建小鼠模型以期明确PD 对NAFLD 的潜在作用及其机制，旨在为后续临床转化奠定基础。

资料与方法

1、动物

SPF 级昆明雄性小鼠（4～6 周龄，15～19 g）40 只，均购置于常州卡文斯实验动物有限公司。

2、试剂及仪器

聚合酶链式反应（PCR）仪：深圳市源博芯电子有限公司；TE2000-倒置荧光显微镜：上海光密仪器有限公司；TS100 倒置显微镜：北京普瑞赛司仪器有限公司；Gene Genius 凝胶分析系统：济南来宝医疗器械有限公司；Gellogic 200 凝胶成像分析系统：广州光仪生物科技有限公司；激光共聚焦显微镜AIR+9：南京伊若达仪器设备有限公司；胆酸钠、果糖、胆固醇购置于武汉兴起点生物科技有限公司；多聚甲醛、中性树脂购置于济南腾博化工有限公司；琼脂糖粉：上海易佰聚经贸有限公司；总RNA 提取试剂盒：上海语纯生物科技有限公司；逆转录试剂盒：上海研尊生物科技有限公司；酶联免疫吸附试剂盒：上海研尊生物科技有限公司。

3、分组及给药

随机将40 只小鼠分为5 组，即高剂量组（HFD+100PD组，8只）、中剂量组（HFD+100PD组，8只）、低剂量组（HFD+50PD 组，8 只）、模型组（8 只）和NC 组（8 只）。NC 组采用普通饲料（能量比：脂肪20%，蛋白质60%，碳水化合物20%）喂养；高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组均采用高脂饲料喂养（编号D12492，能量比：脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%）+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1 只小鼠观察建模情况。确定建模成功后进行后续研究，既NC组和模型组采用1 ml/100 g生理盐水灌胃4周，HFD+50PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌胃干预。

4、观察指标

4.1、常规指标 每周称量小鼠体质量，尾静脉取血检测空腹血糖；药物干预结束后，麻醉处死动物，留取血清、肝脏组织标本，并计算肝脏指数（liver index，LI）=［肝质量（g）/体质量（g）×100%］。

4.2、血清生化指标的检测 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清及肝脏组织TG、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

4.3、小鼠肝组织苏木素-伊红（HE）和油红O染色（脂质沉积） 处死小鼠后取右叶肝脏组织，并进行固定（固定采用4%多聚甲醛溶液），脱水后进行常规封蜡操作，随后进行HE 染色，并在正置显微镜下观察肝脏组织形态和膨胀情况。

4.4、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 采用TRIzol Reagent提取肝组织中总的RNA，并在98 ℃、50 ℃和37 ℃条件下进行逆转录操作，操作严格按照试剂盒说明书进行，待逆转录为cDNA 后进行RT-PCR 扩增。反应条件为：反应共进行40 个循环，其中65 ℃1 min，95 ℃15 s，95 ℃10 min。均采用GAPDH 作为内参，参考2-△△CT检测SREBP-1c、Akt、ACC、FAS的mRNA相对表达水平。

4.5、蛋白质印迹法 取200 mg 肝组织，滴入裂解液后提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白浓度测定，并常规进行电泳分离等操作，完成后采用凝胶成像仪分析系统，以GAPDH 作为内参进行肝脏AMPK（AMPK/pAMPK）的蛋白相对表达水平的半定量分析。

5、统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据统计。正态分布的计量资料以（±s）表示，两两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1、各组小鼠HE染色结果

本实验结果显示，正常的肝组织以中央静脉为中心，肝细胞排列紧密，肝血窦与肝板排列形态规则，呈放射状，而模型组肝细胞形态不规则，且出现膨胀的状态，同时肝组织中存在较多脂肪空泡；结果显示，HFD+200PD 组肝组织排列紧密和脂肪空泡情况均优于HFD+100PD 组、HFD+50PD组、模型组，且HFD+100PD 组显著优于HFD+50PD 和模型组。

2、各组小鼠AMPK通路表达情况

HFD+200PD 组P-AMPK、AMPK 蛋白相对表达量显著高于HFD+100PD 组、HFD+50PD 组和模型组（均P＜0.05），且HFD+100PD 组显著高于HFD+50PD 组和模型组，但4 组均显著低于NC组（均P＜0.05），见表1。

表1 各组SPF级昆明雄性小鼠AMPK通路表达情况（± s，n=8）

表1 各组SPF级昆明雄性小鼠AMPK通路表达情况（± s，n=8）

注：NC 组采用普通饲料（能量比：脂肪20%，蛋白质60%，碳水化合物20%）喂养；高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组均采用高脂饲料喂养（编号D12492，能量比：脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%）+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1 只小鼠观察建模情况；确定建模成功后进行后续研究，既NC 组和模型组采用1 ml/100 g 生理盐水灌胃4 周，HFD+50PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃 干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌 胃 干 预。PD 为 虎 杖 苷。与NC 组 比 较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与HFD+50PD 组比较，cP＜0.05；与HFD+100PD组比较，dP＜0.05

组别HFD+200PD组HFD+100PD组HFD+50PD组模型组NC组F值P值P-AMPK 0.89±0.02abcd 0.78±0.02abc 0.68±0.03a 0.53±0.12a 1.03±0.12 10.57＜0.01 AMPK 0.84±0.02abcd 0.67±0.03abc 0.58±0.04a 0.47±0.06a 1.10±0.10 8.44＜0.01

3、各组小鼠肝脏组织中脂质合成相关基因表达情况

HFD+200PD 组SREBP-1c、ACC、FAS mRNA 相对表达量显著低于HFD+100PD 组、HFD+50PD 组和模型组，而Akt mRNA显著高于HFD+100PD组、HFD+50PD组和模型组（均P＜0.05），见表2。

表2 各组SPF级昆明雄性小鼠肝脏组织中脂质合成相关基因表达情况（± s，n=8）

表2 各组SPF级昆明雄性小鼠肝脏组织中脂质合成相关基因表达情况（± s，n=8）

注：NC 组采用普通饲料（能量比：脂肪20%，蛋白质60%，碳水化合物20%）喂养；高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组均采用高脂饲料喂养（编号D12492，能量比：脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%）+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1只小鼠观察建模情况；确定建模成功后进行后续研究，既NC 组和模型组采用1 ml/100 g 生理盐水灌胃4 周，HFD+50PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌胃干预。PD 为虎杖苷。与NC组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与HFD+50PD组比较，cP＜0.05；与HFD+100PD组比较，dP＜0.05

组别HFD+200PD组HFD+100PD组HFD+50PD组模型组NC组F值P值SREBP-1c mRNA 1.23±0.10abcd 1.45±0.08abc 1.67±0.11ab 2.21±0.14a 1.01±0.12 11.23＜0.01 Akt mRNA 0.82±0.03abcd 0.68±0.03abc 0.51±0.02ab 0.32±0.06a 0.98±0.17 9.57＜0.01 ACC mRNA 1.43±0.21abcd 1.79±0.18abc 2.28±0.13ab 2.87±0.18a 1.03±0.21 12.21＜0.01 FAS mRNA 1.58±0.06abcd 1.95±0.08abc 2.25±0.11ab 2.91±0.11a 1.08±0.17 8.54＜0.01

4、各组小鼠血清生化指标表达情况

HFD+200PD 组TC、TG 和LDL-C 表 达 量 显 著 低 于HFD+100PD、HFD+50PD 和模型组（均P＜0.05），且HFD+100PD组显著低于HFD+50PD和模型组，但4组均显著高于NC组（均P＜0.05），见表3。

表3 各组SPF级昆明雄性小鼠血清生化指标表达情况（mmol/L，± s，n=8）

表3 各组SPF级昆明雄性小鼠血清生化指标表达情况（mmol/L，± s，n=8）

注：NC 组采用普通饲料（能量比：脂肪20%，蛋白质60%，碳水化合物20%）喂养；高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组均采用高脂饲料喂养（编号D12492，能量比：脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%）+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1 只小鼠观察建模情况；确定建模成功后进行后续研究，既NC 组和模型组采用1 ml/100 g 生理盐水灌胃4 周，HFD+50PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干预；HFD+100PD 组给予高脂饲料+高糖饮水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌胃干预。PD 为虎杖苷。与NC 组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与HFD+50PD 组比较，cP＜0.05；与HFD+100PD组比较，dP＜0.05

组别HFD+200PD组HFD+100PD组HFD+50PD组模型组NC组F值P值TC 5.24±0.17abcd 6.98±0.13abc 8.54±0.21ab 11.87±1.54a 3.89±0.12 8.67＜0.01 TG 0.78±0.05abcd 1.10±0.01abc 1.35±0.11ab 1.87±0.21a 0.21±0.03 11.54＜0.01 LDL-C 2.57±0.12abcd 2.67±0.12abc 2.98±0.21ab 4.65±0.45a 1.97±0.21 9.54＜0.01

讨 论

祖国医学典籍中未见脂肪肝之名，依据疾病特点可归属于“肥气”“痞满”“痰浊”“胁痛”“积聚”等范畴［6］。《灵枢·百病始生》有载：“湿气不行，凝血蕴里而不散”；《素问·五常政大论》有载：“饮食自倍，肠胃乃伤”；《医学入门》有载：“善食厚味者生痰”；《临证指南医案·湿》有载：“阴之五宫，伤在五味”；痰瘀互结、湿热内蕴、痰浊内阻、肾气亏虚、肝失疏泄和脾失健运是本病的主要病机，而过食肥甘厚味致使肝脏脂肪沉积是本病的核心病因［7］。虎杖具有利湿、破瘀、清热等功效，典籍记载其在胁痛、黄疸和肥胖等疾病的治疗中效果卓越［8］。现代药理学研究发现，其主要活性成分PD 在保肝、降血脂方面具显著功效［9］。但其在NAFLD 患者肝脏脂质沉淀中的作用机制仍未被系统报道。

本实验结果显示：高脂饮食饲养16 周后，模型组、HFD+200PD 组、HFD+100PD 组、HFD+50PD 组血清TG、TC、LDL-C 水平均显著高于NC 组，提示NAFLD 小鼠模型构建成功。AMPK 信号通路是维持细胞能量稳态和调控肝脏脂质稳态的核心枢纽。AMPK 是由γ 亚基（38 kDa）、β 亚基（38 kDa）和α 亚基（63 kDa）组成的异源三聚体，其中β、γ为调节亚基，α 为催化亚基。研究证实，当机体出现热休克、缺血、缺氧、低血糖等应激并引起细胞供能不足后AMP 的表达随之上调，而过表达的可通过与γ亚基结合激活AMPK的表达。脂质沉积相关研究发现，AMPK 信号通路的激活可缓解高脂饮食引起的脂质沉积，如靶向调节AMPK 的磷酸化可抑制脂质沉积［10］、熊果酸可通过介导AMPK 信号通路的表达改善肝细胞的脂肪沉积［11］。本实验结果显示：HFD+200PD组P-AMPKα、AMPK蛋白表达水平均显著高于HFD+100PD 组、HFD+50PD 组和模型组，且HFD+100PD 组显著高于HFD+50PD 组模型组，但均低于NC 组，提示NAFLD 模型采用PD 干预后可靶向调节AMPK 信号通路的表达。SREBP-1c、Akt、ACC、FAS是参与调控机体脂质合成的重要基因。Kim 等［12］证实，SREBP-1c 的表达上调与脂肪肝发生、发展密切相关。朱艳萍等［13］证实，Akt 的磷酸化水平降低可继发调控下游信号分子表达，进而促进脂质沉积。戴江东等［14］发现，FAS 通路是参与介导NAFLD 脂质平衡代谢紊乱的重要信号源。龚美蓉等［15］发现，抑制ACC 的表达后可显著改善肥胖大鼠脂质沉淀现象。本次实验结果显示：HFD+200PD组SREBP-1c、FAS、ACC的mRNA 相对表达水平显著低于HFD+100PD 组、HFD+50PD 组和模型组，且HFD+100PD 组显著低于HFD+50PD 组和模型组，但均显著高于NC 组，而HFD+200PD 组Akt mRNA 水平显著高于HFD+100PD 组、HFD+50PD 组和模型组，提示PD 可通过调节脂质合成相关基因的表达改善NAFLD 小鼠肝脏脂质沉积情况。进一步分析肝组织HE 染色结果显示，HFD+200PD 组肝组织排列紧密和脂肪空泡情况均优于HFD+100PD组、HFD+50PD组和模型组，且HFD+100PD组显著优于HFD+50PD组和模型组，证实PD治疗可显著改善NAFLD小鼠的肝脏脂质沉积，且药效呈现剂量依赖性，即给予小鼠较大剂量灌胃可显著增加疗效。

综上所述，非酒精性脂肪肝采用PD 治疗后可显著改善肝脏脂质沉积现象，且增加服药剂量可显著提升疗效，其机制可能与靶向调节AMPK 信号通路的激活和抑制相关脂质合成因子表达有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突