高滢张青鸭頭辉山岨達也岩崎真一张滟马伟军陈耔辰张玉忠许珉任晓勇*

1西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科

2日本东京大学耳鼻咽喉头颈外科

3上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉头颈外科，上海交通大学医学院耳科学研究所，上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

4日本名古屋市立大学耳鼻咽喉头颈外科

前庭神经系统障碍可导致动物和人类空间定位和平衡功能紊乱。近年来，随着各种前庭功能障碍动物模型的建立，人们对实验动物前庭功能的评价也越来越关注[1]。因为缺乏像听觉诱发电位（Auditory Evoked Potentials,AEP）那样稳定可靠的指标，我们对实验动物前庭损伤的评价手段还远不如对耳蜗损伤评价那么敏感、客观、自信。现有的动物前庭功能评价方法包括：1.一般行为观察：包括游泳实验等[2]；2.空间姿势反射：用于评价动物前庭末梢的感受性和前庭脊髓神经的反射情况；3.前庭眼反射（Vestibular Ocular Reflex,VOR）检测[3,4]：一般用于半规管功能检测，需要特殊设备且记录难度较大；4.前庭诱发肌源性电位（Vestibular Evoked Myogenic Potential,VEMP）检测[5]：因为受到肌力和肌张力的影响，动物实验仍很困难。

前庭诱发电位（Vestibular evoked potential,VsEP）是近年来国际上出现的一种用于动物内耳前庭成分检测的实验方法。现有的研究表明它是来自前庭系统的远场电位，而不是肌电位；刺激源通常是振动刺激，而不是声刺激；这种振动刺激通常需要精确良好的控制与检验，施加于动物颅骨后通过头皮电极记录得到VsEP反应。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取6只体重20-30g健康成年JCR雄性小鼠，8周龄，所有小鼠健康，鼓膜完整，无听力障碍。研究通过了校伦理委员会项目审批（编号：No 2019-1072）。实验组给予庆大霉素220mg/kg/day皮下注射，对照组给予等量生理盐水皮下注射，连续注射14天。

1.2 实验方法

1.2.1 动物固定及VsEP检测装置连接

将两组小鼠给药后进行VsEP实验，塞拉嗪(10mg/kg)+氯胺酮(40mg/kg)麻醉后将俯卧位小鼠头部固定于头部固定器（型号SG-4N，日本）内，前门牙勾于上颌固定环，双侧耳前使用螺丝旋转固定（图1A）。固定器与振动发生装置(图1B)相连（型号S-0105，旭製作所，日本）相连，产生两种振动形式的振动波：带斜坡的对称抛物线波（symmetric par‐abolic waves with ramps,SPR，或称triangular wave，三角波），及具有线性加速度和斜坡的对称抛物线波（symmetric parabolic waves with linear acceleration and ramps,SPLR，或称square wave，矩形波）。加速度传感器（型号352C65，PCB Piezotronics，美国）及压力传感器（型号P51，PCB Piezotronics，美国，图1C）用于检测和标定振动加速度，使VsEP刺激能量peak-jerk为0dB re.1g/ms.典型有效的刺激波形为1ms开始至2ms（peak-jerk波，图1D）[6]。振动脉冲由14.5dB re.1g/ms输出开始，依次递减10dB，不能引出稳定波形时再回升5dB脉冲刺激直至波形稳定，重复性良好。每振动强度刺激下波形至少重复测试至少2次以确保结果稳定可靠。

图1 振动刺激前庭诱发检测系统各部件示意图A小鼠头部固定装置（型号SG-4N，日本）；B振动发生装置；C加速度传感器及压力传感器；D振动发生装置产生的两种振动形式波（SPR，SPLR）。Acceleration（加速度）在2ms内提升至4.2g，Jerk（脉冲）反应刺激冲击幅度（加速度的一阶倒数 dg/dt）。Fig.1 Vibration exciter generate vestibular evoked potential system;A:mouse head fixing frame（Type SG-4N，Japan）;B:Vibration exciter generator;C:Acceleration and pressure sen‐sors;D:The raw acceleration waveforms and the jerk wave‐forms of the vibration exciter with SPR or SPLR waveform with differential calculation of the digital oscilloscope.Accel‐eration elevate to 4.2g in 2ms，Jerk reflect the magnitude of stimulus(The reciprocal of the acceleration dg/dt）.

1.2.2 前庭诱发电位VsEP波形判定标准和参数记录

采用美国智听（Smart EP IHS）听觉诱发电位仪进行VsEP波形记录。银针记录电极置于颅顶，接地及参考电极分别置于双耳后区域。典型的VsEP为短潜伏期（在2ms内）出现的N1-P1波，重复性良好，否则认为波形消失或未引出。分别记录SPR及SPLR两种振动刺激形式下的波形，刺激强度从14.5dB re.1g/ms脉冲刺激开始，依次递减10dB，波形无法引出时回升5dB，每个强度刺激下至少重复两次直至波形消失，记录上一刺激强度为阈值。记录参数包括刺激阈值，14.5dB re.1g/ms脉冲刺激下N1潜伏期及N1/P2振幅。

1.2.3 听性脑干反应ABR测试

分别给予频率为 4kHz，8kHz，16kHz，32kHz Tone burst刺激，刺激强度从100dB SPL开始，刺激频率21.1次/s，平均250次，直至ABR波形消失，上一刺激强度记录为阈值。

2 结果

2.1 VsEP测试结果及参数

所有小鼠VsEP波形均可正常引出，在SPR及SPLR振动刺激下阈值，14.5dB re.1g/ms脉冲刺激下N1潜伏期、N1/P1振幅结果比较见表1。正常组及庆大霉素处理组在SPLR振动刺激下阈值及N1/P1振幅比较具有统计学差异。

2.2 ABR测试结果及参数

对照组及庆大霉素处理组小鼠ABR波形皆可正常引出。将V波消失时的短纯音刺激定义为阈值。对照组在4kHz短纯音刺激下阈值为67.3±2.9dB SPL;在8kHz短纯音刺激下阈值为29.3±8.1dB SPL;在16kHz短纯音刺激下阈值为29.7±4.5dB SPL;在32kHz短纯音刺激下阈值为51.0±8.7dB SPL。庆大霉素处理组在4kHz短纯音刺激下阈值为77.3±5.8dB SPL(与对照组比较t=0.443，P=0.670);在8kHz短纯音刺激下阈值为52.3±11.5dB SPL(与对照组比较 t=1.868，P=0.100);在16kHz短纯音刺激下阈值为61.7±12.6dB SPL(与对照组比较t=2.304，P=0.050)，在 32kHz短纯音刺激下阈值为78.7±4.6dB SPL(与对照组比较t=0.971，P=0.360)。ABRI波潜伏期及振幅见表1。

2.3 VsEP典型N1-P1波形及与ABR I波的鉴别

图2 A所示为各频率振动脉冲下正常小鼠及庆大霉素注射小鼠VsEP引出波。图2B所示为4kHz声刺激下正常小鼠及庆大霉素注射小鼠ABR各个引出频率波形示例，VsEP典型N1-P1波为2ms内出现先负-正波形，而ABR的I波出现在2ms左右，N1波与I波潜伏期的比较见图2C，蓝色线条为4kHz在99dB SPL的ABR波形，红色线条为SPR在4.5dB re.1g/ms的VsEP波形，明显可见VsEP波N1潜伏期与ABR波I潜伏期差异。ABR的I波来源于听神经纤维，ABR的I波区别于VsEP的P1波，其潜伏期更长，通常在2ms左右，而VsEP的N1波潜伏期通常在1ms左右（见表1）。

表1 各组前庭诱发电位（VsEP）及听性脑干反应（ABR）参数比较（±s）Table 1 Comparison of parameters in VsEP and ABR between the two groups（±s）

表1 各组前庭诱发电位（VsEP）及听性脑干反应（ABR）参数比较（±s）Table 1 Comparison of parameters in VsEP and ABR between the two groups（±s）

*Comparing with control group P<0.05,**Comparing with control group P<0.01

VsEP Threshold（dB）images/BZ_118_985_2197_1028_2240.pnglatency of N1 wave in VsEP（ms）images/BZ_118_1281_2197_1325_2240.pngAmplitude of N1-P1 wave in VsEP（μV）latency of I wave in ABR（ms）images/BZ_118_1599_2197_1642_2240.png32kHz 2.6 2.3 2.2 2.4±0.2 2.5 2.4 2.4 2.4±0.1 0.535 0.621 Control group Gentamicin group 1#2#3#images/BZ_24_1766_2589_1789_2624.png±s 4#5#6#images/BZ_24_1766_2589_1789_2624.png±s t P SPR-10.5-15.5-10.5-12.2±2.9-0.5-10.5 5.5-1.8±8.1 2.085 0.105 SPLR-15.5-15.5-10.5-13.8±2.9-0.5 5.5 5.5 3.5±3.4**6.658 0.003 SPR 1.2 1.2 1.0 1.1±0.1 1.1 1.2 1.0 1.1±0.1 0.378 0.724 SPLR 1.2 1.0 0.7 1.0±0.3 0.9 1.1 1.2 1.1±0.1 0.588 0.588 SPR 28.4 7.3 14.6 16.8±10.7 11.4 13.6 0.95 8.7±6.8 1.110 0.329 SPLR 18.2 10.1 17.9 15.4±4.6 3.5 1.3 4.6 3.1±1.7*4.345 0.012 4kHz 1.9 2.0 2.2 2.0±0.2 2.2 2.3 2.1 2.2±0.1 1.581 0.190 8kHz 1.8 1.9 2.1 1.9±0.2 2.2 2.2 2.1 2.2±0.1 2.475 0.067 16kHz 2.3 2.1 2.3 2.2±0.1 2.0 2.1 2.2 2.1±0.1 1.512 0.205

图2 振动刺激诱发的小鼠VsEP与声刺激诱发ABR波形比较。A SPR振动刺激条件下庆大霉素处理组与正常对照组小鼠VsEP典型波形；B 4kHz声刺激条件下庆大霉素处理组及正常对照组小鼠ABR典型波形；C ABR波形与VsEP波形比较（蓝色标识为小鼠ABR波形，红色标识为VsEP波形）。Fig.2 Comparison between vibration exciter generate VsEP wave and click generate ABR wave.A:Typical VsEP waves in gentamicin group and control group of SPR stimulation waveform;B:Typical ABR waves in gentamicin group and control group of 4kHz click stimulation waveform;C:Com‐parison of ABR wave and VsEP wave(blue line represents ABR wave,red line represents VsEP wave).

3 讨论

线性机械振动刺激诱发的前庭诱发电位（VsEP）源于前庭，不同于耳蜗反应的迷路电信号，是可能来源于耳石器与前庭神经的复合动作电位。其与VEMP不同的是：1.潜伏期不同：VsEP为短潜伏期电位,潜伏期<2ms；VEMP潜伏期为10-20ms。2.电活动来源不同。VsEP记录位置在颅顶，电活动来源于前庭神经或脑干；而VEMP记录位置位于眼肌或胸锁乳突肌表面，电活动来源于肌细胞[7,8]。1991年Arulkumaran首次将VsEP应用于人。将头部固定于一个针对每个对象单独制造的固定器中，用以支持上颚牙齿与固定器贴合固定良好且稳定。电极刺激产生2/s每次的角加速度，强度为10000°/S2（速度上升时间为1-2ms）。记录前额与乳突间的电位差。1996年Rodionov[9]给予正常人头部在垂直平面上10000°/S2(1.8°位移)的角加速度刺激，分别于前额和乳突表面记录到平均12.7ms及63.5ms的中潜伏期电位。此后对于人振动刺激诱发VsEP鲜有报道。

VsEP来源于耳石器、半规管还是前庭神经，最初尚不确定。Jones于1989年在鸟类的研究中最先报告和定义这些VsEP波的来源[10，11]，随后于1999年利用远场记录的方法描述了四种哺乳动物（大鼠，小鼠，豚鼠和沙鼠）的迷路重力感受器功能。VsEP是通过施加在颅骨上的线性加速度振动引起的前庭神经和中枢的复合动作电位，这四种哺乳动物的VsEP都发生在1.5ms以内。1999年Jones对Het基因突变小鼠采用VsEP检测其前庭功能[12]。Het基因突变小鼠又称倾斜小鼠[13]，先天缺失耳石器，而半规管及耳蜗都存在。Jones发现这种小鼠对click声刺激可产生听觉反应出现ABR波形，但VsEP波形消失，提示VsEP可能来源于耳石器。2013年Yas‐uhiro[14]手术选择性分别切除豚鼠耳蜗、半规管，椭圆囊或球囊后发现耳蜗、半规管及球囊切除均不影响VsEP波形引出，而椭圆囊切除后VsEP波消失。他们的研究进一步提示VsEP可能来源于椭圆囊。

众所周知，机械振动本身也是潜在的声刺激来源，线性机械振动刺激诱发的VsEP是否会同时诱发耳蜗听神经产生ABR波对结果判读产生干扰？为此Jones等设计了听觉掩蔽装置，这种掩蔽装置可以产生强大的宽带前向掩蔽刺激（116dB SPL，50-50000Hz），在检测时持续给予这种掩蔽刺激可以避免耳蜗听成分参与VsEP的形成[15]。而实际应用的掩蔽水平则高于消除听觉反应所需的最低水平。Jone发现在不添加掩蔽的het小鼠仍无VsEP波，且很少出现听觉“伪像”。Bohmer[16]同样于无听觉掩蔽的小鼠记录到稳定VsEP波形。在本研究中，我们使用了未添加掩蔽的振动刺激，同样也观察到稳定的VsEP波形，并无ABR的波形干扰。因此可以认为线性机械振动刺激诱发的VsEP可以选择性地反映前庭耳石器的功能，听觉掩蔽可能并不是必须要考虑的科学问题。VsEP来源于前庭基于：1.在给予强烈的宽带前向掩蔽（116dB SPL，50-50000Hz）的VsEP检测过程中，动作电位持续存在；2.VsEP在双侧耳蜗切除后保留，而双侧迷路切除后消失[12]。

综上所述，振动刺激诱发的VsEP前庭功能检测系统的优势在于它是来源于前庭的远场电位而不是肌电位，可以很好地弥补肌电位的不足并与之相互印证。VsEP的检测方法较其它前庭功能检测方法更加简便易行，麻醉后的动物仅需固定头部进行无损伤的前庭功能评价。与目前常用的低频旋转实验记录眼震波形等检测方法相比，所用仪器价格低廉，操作简便，波形稳定，重复性良好，可广泛开展用于动物实验研究。