孙春涛盛优静杨霞郭翠

1宁夏回族自治区妇幼保健院（宁夏回族自治区儿童医院）（银川 750001）

2北京淦江生物技术有限公司(北京 100176）

耳聋位居我国各类残疾之首，也是常见的出生缺陷之一，新生儿耳聋的发病率大约为1-3‰。耳聋的致病原因复杂，包括遗传因素和环境因素，其中遗传因素约占60%[1]，包括常染色体隐/显性遗传、X-连锁显/隐性遗传、线粒体母系遗传[2]。流行病学调查发现GJB2、SLC26A4、MT-RNR1等基因为中国人群常见致聋基因[3]。针对我国常见耳聋基因热点突变位点进行基因筛查以及采用物理学检测技术进行新生儿常规听力学筛查是耳聋出生缺陷的三级预防手段，在降低耳聋出生缺陷方面具有重要作用。

宁夏回族自治区深处内陆，位于中国西北部的黄河中上游地区，是我国回族长居人口最多的地区。为了解宁夏地区新生儿听力筛查未通过新生儿耳聋基因突变特点以及本地区汉族、回族间耳聋基因突变差异，本研究对宁夏地区960例听力筛查未通过新生儿进行4个常见耳聋基因的15个突变位点进行检测，结果分析如下：

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

2017年9月-2019年12月期间，从银川市妇幼保健院、宁夏医科大学总医院、吴忠市妇幼保健院、中卫市妇幼保健院、石嘴山市妇幼保健院、固原市妇幼保健院等95家助产机构转诊至宁夏回族自治区妇幼保健院（宁夏回族自治区儿童医院）的960例听力初筛、复筛均未通过的新生儿为研究对象，这些新生儿的父母双方或一方为宁夏户籍，汉族600例，占62.5%，回族342例，占35.6%，其他民族（满族、蒙古族）18例，占1.9%。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

充分告知所有受检新生儿父母或监护人本次耳聋基因筛查的目的、意义、条件、方式、灵敏度等情况，并签署知情同意书，由专业人员采集新生儿足跟末梢血，制成含有三个直径大于8mm血斑的干血片，血斑上血液需要渗透均匀。血片需在常温条件下自然晾干，避免紫外照射，并用自封袋独立包装，检测之前放4℃保存。

1.2.2 遗传性耳聋基因检测

（1）核酸提取

采用打孔器在干血片上打取1个直径为6mm的血片置于1.5ml离心管中，采用干血斑核酸提取试剂盒(产品编号：DP334，成都博奥晶芯生物科技有限公司)进行核酸提取，具体操作参照《干血斑基因组DNA提取标准操作规程（十五项耳聋）》。采用赛默飞公司的Nanodrop对提取的DNA进行浓度测定，被检基因组DNA需满足浓度为3-25ng/μL，OD260/OD280为1.8-2.0。

（2）耳聋基因检测

采用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法，产品货号：30068，成都博奥晶芯生物科技有限公司），对4个常见遗传性耳聋基因的15个突变热点进行芯片检测，包括GJB2基因（c.35 del G、c.176 del 16、c.235 del C和c.299_300 del AT）、SLC26A4基因（c.2168 A>G、c.1174 A>T、c.1226 G>A、c.1229 C>T、c.1975 G>C 、c.2027 T>A、c.1707+5 G>A和 c.919-2 A>G）、GJB3基因（c.538C＞T）和MT-RNR1（m.1555A＞G、m.1494C＞T）。本方法以提取的人类基因组DNA为模板，采用带有Tag标签序列的基因位点特异性引物对检测位点所在基因片段进行扩增和荧光生物素标记，再经过磁珠纯化、碱变性，然后与带有检测位点标签序列的通用基因芯片进行杂交，再对芯片洗涤，最后通过对芯片进行扫描和软件结果判读获取检测结果。主要用到的仪器有：PCR仪（S1000，Bio-Rad），芯片洗干仪（晶芯®SlideWasherTM 洗干仪，博奥生物集团有限公司），晶芯®微阵列芯片扫描仪（LuxScan 10K/B，博奥生物集团有限公司），具体操作参照《晶芯®十五项遗传性耳聋相关基因检测盒（微阵列芯片法）标准操作规程》。

1.2.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析，汉族与回族新生儿遗传性耳聋基因突变检出率组间比较采用χ2检验（检验水准α=0.05），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4个常见遗传性耳聋基因突变总体检测结果

960例听力初筛、复筛均未通过新生儿中，102例新生儿检出常见遗传性耳聋基因热点位点突变，检出率为10.63%（102/960），其中携带GJB2基因突变61例，检出率6.35%（61/960），包括纯合突变或复合杂合突变10例，检出率1.04%（10/960），杂合突变48例,检出率5.00%（48/960）；SLC26A4基因突变31例，检出率3.23%（31/960），包括纯合突变6例，检出率0.63%（6/960），杂合突变25例，检出率2.60%（25/960）；GJB3基因杂合突变4例，检出率0.42%（4/960）；MT-RNR1均质突变1例，检出率0.10%（1/960）；双基因突变5例，检出率0.52%（5/960），包括GJB2基因复合杂合以及线粒体异质突变1例（见表1）。

表1 102例检出耳聋基因突变的基因型分布Table 1 The genotype of 102 positively detected newborns

2.2 4个常见遗传性耳聋基因突变在回、汉族中的检测结果

960例听力筛查未通过新生儿中，汉族600例，检出4个常见遗传性耳聋基因突变59例，总检出率9.83%（59/600）；回族342例，检出4个常见遗传性耳聋基因突变42例，总检出率12.28%（42/342），其他民族（满族、蒙古族）18例，检出4个常见遗传性耳聋基因突变1例，总检出率5.56%（1/18），由于宁夏地区满族、蒙古族人群较少，本研究不对其检测结果进行详细分析。汉族与回族的遗传性耳聋基因突变检出率分别是9.83%、12.28%，经卡方检验，差异无统计学意义（P>0.05）;GJB2基因在汉族、回族新生儿中的检出率分别是4.83%、9.06%，回族高于汉族，差异有统计学意义（χ2=6.53，P<0.05）（见表2）。

表2 回、汉族中4个常见遗传性耳聋基因突变检测结果Table 2 Detection results of 4 common genetic mutations of deafness Hui and Han nationalities

2.3 4个常见耳聋基因突变位点在回、汉族中分布特点

在听力筛查未通过的600名汉族新生儿中，2例（0.33%）携带GJB2:c.235delC纯合突变，1例（0.17%）携带GJB2:c.176del16/c.235delC复合杂合突变，19例（3.17%）携带GJB2:c.235delC单杂合突变，6例（1.00%）携带GJB2:c.299delAT单杂合突变；4例（0.67%）携带SLC26A4:c.919-2A>G纯合突变，1例（0.17%）携带SLC26A4:c.1174A>T纯合突变，10例（1.67%）携带SLC26A4:c.919-2A>G单杂合突变；3例（0.50%）携带SLC26A4:c.2168A>G单杂合突变，4例（0.67%）新生儿携带GJB3:c.538C>T杂合突变，5例（0.83%）携带双基因突变。

表3 回、汉族中4个常见遗传性耳聋基因突变位点分布Table 3 Distribution of 4 common genetic deafness gene mutation sites in Hui and Han nationalities

在听力筛查未通过的342例回族新生儿中，4例（1.17%）携带GJB2:c.235delC纯合突变，1例（1.17%）携带GJB2:c.299delAT纯合突变，2例（0.58%）携带GJB2:c.235delC/c.299delAT复合杂合突变，14例（4.09%）携带GJB2:c.235delC单杂合突变，6例（1.75%）携带GJB2:c.299delAT单杂合突变；1例（0.29%）携带SLC26A4:c.919-2A>G纯合突变，6例（1.75%）携带SLC26A4:c.919-2A>G单杂合突变；1例（0.29%）携带SLC26A4:c.2168A>G单杂合突变，1例（0.29%）新生儿携带MT-RNR1：m.1555A>G均质突变。

3 讨论

耳聋是一种严重影响生活质量的出生缺陷，也是临床上最常见的遗传性疾病之一。我国每年新增6-8万耳聋患儿，其中60%左右是由于遗传因素导致，GJB2、SLC26A4、MT-RNR1、GJB3是我国常见致聋基因，这4个基因导致的耳聋占所有遗传性耳聋的70%左右[4]，因此，通过开展常见耳聋基因检测以明确分子病因，对于耳聋的预防至关重要。

研究表明，北京朝阳区以及山东菏泽听力复筛未通过的新生儿中，4个常见耳聋基因检出率分别为21.91%[5]、6.85%[6]，本研究发现 4个常见致聋基因15个热点突变位点在960名听力筛查未通过新生儿中的总体检出率为10.63%，与文献报道数据不一致，可能与听力筛查手段、筛查人数、筛查基因突变位点数量有关，也不能排除耳聋基因突变位点存在民族与地域差异，此外，部分新生儿可能由于胎脂或羊水堵塞外耳道导致听力筛查“假阳性”导致耳聋基因检出率差异较大，需进一步研究。本研究中，GJB2、SLC26A4、MT-RNR1、GJB3的检出率分别为6.35%、3.23%、0.42%、0.10%，主要以GJB2基因c.235delC突变为主，其次是SLC26A4基因c.919-2A>G突变为主，与文献报道一致[6,7]。本研究发现61例新生儿携带GJB2基因突变，其中纯合突变或复合杂合突变10例，检出率1.04%（10/960），杂合突变48例,检出率5.00%（48/960）；SLC26A4基因突变31例，检出率3.23%（31/960，包括纯合突变6例，检出率0.63%（6/960），杂合突变25例，检出率2.60%（25/960），研究表明GJB2、SLC26A4基因突变的患者病变部位主要在耳蜗，采用人工耳蜗植入术的预后及康复效果较好[8]，因此，建议尽快对检测发现的纯合突变或复合杂合突变新生儿进行听力学诊断，并采用适当的治疗干预手段避免影响语言发育障碍。研究表明，SLC26A4基因上迄今为止已发现170多种以上的突变与大前庭导水管综合症密切相关[9]，但单杂合突变出现耳聋的概率与正常人一致[3]，GJB2基因中也已经鉴定了100多种不同的致病突变[http://davinci.crg.es/deafness/]，且不同突变类型可能出现不同听力表型，因此为进一步预测本研究发现的73例杂合突变（GJB2基因杂合突变48例、SLC26A4基因杂合突变25例）新生儿的未来听力状况并为患者提供精准的遗传咨询指导，建议对杂合突变新生儿进行相应基因全序列测序。本研究发现4例新生携带GJB3基因突变、1例新生儿携带线粒体MT-RNR1:m.1555 A>G均质突变，GJB3基因突变与显性遗传高频听力下降有关，建议对新生儿进行听力诊断以及基因突变家系分析，明确致聋原因并进一步进行听力学干预；线粒体MT-RNR1基因突变患者对氨基糖甙类抗生素高度敏感，可能因摄入此类药物引起永久性耳聋，建议详细了解母亲孕期用药史，以明确孩子致聋原因，并采用听力学干预手段对孩子进行及时干预治疗。

研究表明，不同地区、不同种族人群携带的耳聋基因热点突变存在差异[10]，本研究发现，宁夏地区汉族、回族中4个常见遗传性耳聋基因总检出率分别为9.83%、12.28%，回族突变率高于汉族，与文献报道一致[11]，但汉族、回族间耳聋基因检出率无统计学差异，可能与筛查样本量有关，经进一步研究。本研究中，GJB2基因在回族中的检出率显著高于汉族，与文献报道一致[11]，说明宁夏地区常见耳聋基因突变具有其独特的民族特点，本研究结果能进一步指导回族人群耳聋防治工作。

本研究中，汉族与回族人群GJB2基因突变均以c.235delC杂合突变为主，其次c.299delAT杂合突变，与文献报道一致[12]，汉族新生儿中未检出GJB2基因c.35delG突变位点，回族新生儿中检出2例，可能是由于回族中有较大比例的高加索人种的混杂所致[13-14]。本研究中，SLC26A4基因在回族和汉族新生儿中均以c.919-2 A>G突变位点为主，与文献报道一致[15]，本研究对SLC26A4基因上共8个热点突变位点进行检测，结果发现在汉族和回族新生儿中均未检测到c.2027T>A、c.IVS15+5G＞A位点，汉族新生儿中未检测出c.1226G>A，回族新生儿中未检测出c.1975G>C、c.1174A>T，可能与检测样本量有关。本研究中，汉族人群检出GJB3:c.538C>T杂合突变4例以及5例双基因杂合突变，回族人群未检出该类型突变，可能种族或检测人数有关，需进一步分析。

综上所述，宁夏地区新生儿听力筛查未通过新生儿中，GJB2基因突变检出率最高，其次是SLC26A4基因，且GJB2基因在回族新生儿中的突变检出率显著高于汉族，汉、回民族新生儿中均以GJB2基因c.235delC以及SLC26A4基因c.919-2A>G突变为主，四个常见耳聋基因其他突变位点也呈现出一定的地域与民族特点。本研究结果能在一定程度上指导该地区耳聋基因诊断和遗传咨询，为政府制定有效的针对性的防聋治聋的政策提供依据。