范卫锋，王秋燕，李皓翔，邹园生，梅全喜，钱正明*

(1.广州中医药大学，广东 广州 510011；2.宜昌山城水都冬虫夏草有限公司，湖北 宜昌443300；3.深圳市宝安纯中医治疗医院，广东 深圳 518102)

冬虫夏草是我国传统名贵中药，已有一千多年的药用历史，为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(BerK.) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，具有补肾益肺、止血化痰的功效，临床上用于肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘、劳嗽咯血等[1]。中医学认为“肾精”是生命的本原性物质，贯穿人体生长、发育、壮实、生殖、衰老、死亡各个阶段，能养骨、充髓、健脑、化血、生气，生成生殖之精和御邪抗病的正气[2]。现代医学研究发现肾精与免疫、遗传、神经、内分泌、生殖、造血等有关[3，4]，肾精亏虚易导致免疫功能下降、儿童发育不良、骨质酥松、不孕不育、老年病等[5]。冬虫夏草具有补肾益精的功效，临床上运用冬虫夏草治疗少精不育症，提高精子质量，减缓慢性肾功能衰竭进程[6，7]，但其补肾的物质基础及其作用机制尚不清楚。本研究通过网络药理学分析冬虫夏草治疗肾精亏虚证的成分和作用机制，以期进一步为临床上应用提供生物学依据。

1 材料与方法

1.1 冬虫夏草主要活性化合物的筛选

本研究依托TCMSP、CNKI、PuBmed检索冬虫夏草的主要活性化合物，以口服吸收利用度(OB)≥30%，药物类药性(DL)≥0.18为指标筛选，筛选后得到冬虫夏草的有效成分。

1.2 冬虫夏草预防肾精亏虚靶点的收集和预测

利用TCMSP、Drugbank、Stitch、Swiss target prediction查询冬虫夏草的靶点信息；检索GeneCard、OMIM数据库，以“kidney essence deficiency”为关键词，选择物种为Homo sapiens，检索与肾精亏虚相关的基因；通过R软件包对冬虫夏草活性成分作用的靶点和肾精亏虚靶点取交集并绘制韦恩图，获得共同靶点基因。

1.3 冬虫夏草活性成分-靶点网络的建立

用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理，建立冬虫夏草活性成分-靶点网络图。

1.4 冬虫夏草PPI 网络图和频次分布图的构建

将筛选出的共同靶点基因导入String数据库，将蛋白种类定义为Homo sapiens进行筛选，最低要求交互分数设置为中等(0.4)，获得蛋白互作网络图(PPI)，并使用R 3.6.2软件包统计共同靶点在网络中的相互作用的频次，并绘制条形图展示前19位关键靶点。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

采用R 3.6.2的org.Hs.eg.db程序包将药物与基因的交集靶点名转换成基因名，并使用R 3.6.2的colorspace、stringi、ggplot2等程序包进行可视化处理，对GO功能和KEGG通路富集分析，得到冬虫夏草作用的生物学功能和潜在作用肾精亏虚通路信号，绘制气泡图。

2 结果

2.1 冬虫夏草活性成分的筛选

通过分析检索TCMSP数据库与文献[8-9]中冬虫夏草成分，共收集到347个冬虫夏草化合物，根据筛选条件OB≥30%和DL≥0.18进行筛选，得到可供进一步分析的有效成分22个。

2.2 冬虫夏草抗肾精亏虚靶点

根据GeneCards和OMIM数据库检索肾精亏虚的相关基因，共有438个靶点。检索TCMSP、Drugbank、Stitch、Swiss target prediction等数据库得到冬虫夏草22个活性成分相关靶点103个，运用韦恩图R软件包做冬虫夏草活性成分调控的靶点基因与肾精亏虚的靶点基因交集，得到19个共同靶点，见图1；冬虫夏草有13个活性成分参与抗肾精亏虚，见表1。

图1 冬虫夏草与肾精亏虚靶点的韦恩图

表1 冬虫夏草活性成分和靶点相关信息

2.3 冬虫夏草活性成分-靶点网络

采用Cytoscape 3.7.2软件建立冬虫夏草防治肾精亏虚证的化合物-靶点网络模型，构建成完整的网络图，红色“三角形”代表分子，绿色“四边形”代表靶蛋白，“边”代表冬虫夏草活性成分与肾精亏虚靶点相互作用关系。通过网络分析，冬虫夏草有13个活性成分，与肾精亏虚证的19个相关靶点、30条网络关系参与治疗肾精亏虚证，黄豆黄素、花生四烯酸、胆甾醇、11，14-二十碳二烯酸可能为冬虫夏草抗肾精亏虚的核心成分，PTGS2、CNR1、PPARA、SLC6A2为治疗肾精亏虚的重要靶点。从网络图中可以看出黄豆黄素可以调控SP1、NOS1、NOS2、NOS3、MMP3、PTGS2靶点，酒渣碱、川芎哚、黄豆黄素、花生四烯酸等8个活性成分同时调控PTGS2靶点，这表明冬虫夏草多成分、多靶点共同作用肾精亏虚。

图2 冬虫夏草活性成分-共同靶点网络关系

2.4 冬虫夏草PPI网络和频次分布图

将上述19个交集靶点导入String数据库进行PPI网络分析，构建共同靶点的PPI网络。PPI网络图(图3a)包含19个节点，48条边，靶蛋白平均节点度值为5.05。蛋白与蛋白之间线条表示靶点之间相互作用关系，线条越多表示关联度越大，处于较核心位置，如PTGS2、NOS3、CASP3和PPARA等。对全部靶点蛋白(19个)进行统计并绘制条形图(图3b)。

注：a.PPI网络图；b.前19个靶点的频次图。图3 冬虫夏草与肾精亏虚共同靶点PPI图和频次分布

2.5 GO和KEGG通路富集分析

在GO功能分析结果中，在P<0.05基础上对前20功能特征的生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)进行分析。GO分析结果显示，生物过程(BP)主要涉及小分子代谢调节、血压调节、有机羟基化合物转运等；羧酸结合、有机酸结合、血红素结合和四吡咯结合等分子功能(MF)；细胞组分(CC)涉及膜筏、膜微区、膜区和高密度脂蛋白颗粒等，详见图4。

注：a：生物过程；b：分子功能；c：细胞组分。图4 冬虫夏草治疗肾精亏虚靶点的GO富集图

KEGG分析共得到12条信号通路，主要涉及到钙信号通路、精氨酸生物合成信号通路、胆固醇代谢信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路等，将上述信号通路利用R 语言软件进行数据可视化处理得到气泡图(图5)，其中气泡的颜色越红，富集越显著；气泡大小表示通路相关联的基因数量，气泡越大表明富集的基因越多。

图5 冬虫夏草抗肾精亏虚靶点的KEGG富集图

3 结论

肾精亏虚证是指肾精亏损、髓海空虚所致的发育迟缓、未老先衰、成人生殖机能减退、肢体痿弱不用、耳鸣、痴呆等临床表现的总称[10-12]。中医采用补肾益精方治疗肾精亏虚证取得了良好效果[5]，冬虫夏草归肺、肾经，具有明显的补肾益精作用。

本研究通过对冬虫夏草有效成分-靶点网络关系的挖掘，发现冬虫夏草的黄豆黄素、花生四烯酸、胆甾醇、11，14-二十碳二烯酸为核心有效成分，可能在治疗肾精亏虚证中起着重要作用。黄豆黄素有一定的促成骨细胞增殖活性，在低浓度时呈现正相关趋势，随着浓度的增加，细胞增殖明显，但在1×10-5mol·L-1时抑制骨细胞增殖，使骨细胞皱缩、死亡[13]。花生四烯酸上调C-Fos和Egr-1的表达，能诱发细胞的生长，促进生长发育，常常作为食品营养强化剂添加在婴幼食品中[14]。钱正明等[15]研究发现冬虫夏草的虫体、子座均有胆甾醇，其含量在虫体中较高高，其均值为1.78 mg/g，子座中胆甾醇含量较低，其均值为0.61 mg/g。胆甾醇是动物组织(特别在大脑和脊髓组织)的重要物质，参与细胞膜构成、激素合成的生理作用[16]。11，14-二十碳二烯酸降低LPS诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞中NO产生，增加PEG2和TNF-α的产生，改变巨噬细胞对炎症刺激的反应[17]。钙信号通路在细胞存活、增殖、代谢中有着重要作用，Ca2+进入细胞内，激活各种Ca2+依赖性酶，形成Ca2+-CaM，通过活化、磷酸化，激活钙信号通路，张玉琴等[18]研究栝楼桂枝颗粒通过对钙信号通路中促进CREB、CaMKII 的磷酸化，抑制CaM 的表达，对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤具有保护作用。CUI等[19]在鹌鹑体内绒毛尿囊膜实验和多种内皮细胞体外模型试验中，发现四氢巴马汀通过调节精氨酸生物合成通路的促血管生成。WEN等[20]从胆固醇代谢通路的角度阐明尼古丁暴露雌性产前小鼠可导致调节性T细胞衰退，调节性T细胞的衰退诱导自身免疫性疾病。PATIN等[21]发现精氨酸和脯氨酸代谢通路在肌萎缩性侧索硬化症演化过程中起中心作用，与该通路相关的基因肌酸激酶、脯氨酸-4-羟化酶或亚精胺合成酶失调有关。文献研究表明冬虫夏草能补肾阳虚，可显著逆转氢化可的松所致小鼠肾阳虚的活性，升高T-SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC 的水平，改善小鼠运动能力、性腺器官萎缩、减轻肾脏病理变化[22]。

本研究通过文献研究共检索到347个冬虫夏草成分，其中包含核苷类、氨基酸类、肽类、鞘酯类等，这些化合物都具有较强的生物活性，虫草核苷类提取物能抑制明显改善糖尿病肾病小鼠的肾功能，抑制P38和ERK信号通路的活化[23]，氨基酸可以减缓顺铂治疗肺癌患者肾毒性和作为急性肾衰竭患者进行连续性肾脏替代治疗时的补充剂[24，25]，虫草多肽预防由四氧嘧啶诱导的糖尿病性骨质疏松症小鼠的骨质减少，增强骨密度和骨矿含量[26]。但由于OB≥30%和DL≥0.18的筛选条件限制，核苷类、氨基酸类、肽类、鞘酯类等化合物被排除在外。根据文献报道冬虫夏草含有大量的多糖、蛋白类成分，冬虫夏草含有粗蛋白约30%，总糖类约13%[27]，从冬虫夏草中纯化出4.39×104Da的半乳糖甘露聚糖能降低SD大鼠的血清尿素氮和肌酐水平，明显减轻大鼠肾脏细胞病变症状[28-29]；冬虫夏草蛋白能上调Bax诱导凋亡，抑制A549细胞增殖，促进巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-12，激活免疫反应抑制A549细胞增殖[30]。由于冬虫夏草的多糖和蛋白等大分子化合物分子结构复杂，难以准确发现其治疗疾病的靶点，暂未被TCMSP数据库收录。建议未来加强冬虫夏草大分子成分的补肾精亏虚的作用研究，完善冬虫夏草肾精亏虚证的药效物质基础研究。

本研究运用网络药理学探讨冬虫夏草治疗肾精亏虚证的有效活性成分、靶点和通路，为后续进一步试验等提供了理论支持。但还有更多冬虫夏草的活性成分、靶点和通路有待发现，本研究也难以全面解释其治疗肾精亏虚证的作用机制，需要在以后的研究中，针对某一通路和靶点验证冬虫夏草可治疗肾精亏虚证。