张成才，向增旭

(南京农业大学 园艺学院，江苏 南京 210095)

百蕊草(ThesiumchinenseTurcaz.)为檀香科百蕊属多年生半寄生草本植物，以“百乳草”之名始载于《本草图经》。百蕊草作为传统中药在中国已有上千年的应用历史，具有清热解毒、补肾涩精之功效，现代药理学研究表明，百蕊草有良好的抗炎、解热、镇痛、抗菌等作用，有“植物抗生素”的美称[1-2]。百蕊草在中国各地分布广泛，生于靠近水体或水源充分的荒草坡、田埂杂草丛中，在沙地草丛中或石坎边也常见分布，喜温暖湿润气候，喜光照，忌干旱[3]。我国华北、东北、陕西及长江以南地区是百蕊草的主要分布区，目前江苏茅山和安徽滁州为其主要产区，安徽定远县、明光市等地资源量尤为丰富。近年来，随着百蕊草过度采挖和其寄主植物的减少，百蕊草资源越来越少，已不再列入药典[4]。目前，百蕊草需求量不断增加，百蕊草主要以野生品种供应市场，随着野生资源的逐渐减少，栽培品种越来越受重视，百蕊草的半寄生性、种子存在深度休眠、生长周期长及成活率低等生物学特性使人工栽培扩大百蕊草资源难度较大。本课题组通过设施栽培在南京地区成功进行百蕊草的引种栽培，但关于栽培技术研究结果和质量评价标准尚未见系统研究，栽培百蕊草的应用缺乏科学依据。因此，笔者选择百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚作为指标成分并对其含量进行比较分析，以期为栽培百蕊草提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料采集

供试百蕊草ThesiumchinenseTurcaz.采集于2019年6-7月百蕊草成熟期，供收集了10批百蕊草样品，野生与栽培样品各5批，样品编号为YS1-YS5的药材由安徽九华药业股份有限公司提供，来源信息见表1。经南京农业大学园艺学院向增旭副教授鉴定，所购药材均为檀香科植物百蕊草ThesiumchinenseTurcaz.的全草，编号为ZP1-ZP5的药材均采自南京农业大学八卦洲实验基地。

1.2 仪器与试剂

AR5120电子天平(美国AHOMS公司)；Waters AC-QUITY UPLC(Waters公司)；便携式超声波清洗仪(深圳杰拓科技)。百蕊草素标准品(上海源叶公司)；紫云英苷标准品(上海源叶公司)；山柰酚标准品(上海源叶公司)；色谱级甲醇(购自Tedia公司)。其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱(Phenomenex，250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液；梯度洗脱(0 min→5 min→10 min→20 min→45 min，45%→50%→55%→60%甲醇)；进样体积：20 μL；流速：1.0 mL/min；波长：365 nm。

2.2 对照品溶液制备

精密称取干燥至恒重的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚对照品15 mg、10 mg、10 mg，分别置于10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1.500 mg/mL、1.000 mg/mL、1.000 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取干燥栽培品和野生品百蕊草全草药材，剪成5～8 cm小段置于粉碎机中粉碎，准确称取1 g样品粉末，向粉末中加入25 mL甲醇溶液，称定质量；水浴加热回流1 h，放冷，称定质量；用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液[5-6]。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性试验 分别精密吸取对照品与供试品溶液各20 μL，进样分析，分别记录色谱图，各组分理论塔板数均>3 000，分离度>1.5[7]。结果见图1。

2.4.2 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液适量，分别置于10 mL容量瓶，用流动相稀释，定容，配制成不同浓度(μg/mL)对照品溶液。上述对照品溶液各进样20 μL，进样3次，分别记录峰面积，以对照品的质量浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行回归处理，得到回归方程，百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚的回归方程分别为Y=8 301.2X-35 780，R2=0.998 9；Y=43 593X-4 721.2，R2=0.999 9；Y=77 591X+8 355.6，R2=0.999 8，表明百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚在2.00～1 000.00 μg/mL、2.00～400.00 μg/mL和0.05～50.00 μg/mL范围内线性关系良好。结果见图2。

图2 (a)百蕊草素Ⅰ校正曲线；(b)紫云英苷校正曲线；(c)山柰酚校正曲线

2.4.3 精密度试验 取同一供试品溶液(ZP1)，连续进样6次，分别按照“2.1”所述方法测定供试品中各色谱峰的保留时间，对照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的平均保留时间分别为5.110 min、7.354 min、13.674 min，其相对标准差RSD均小于1%，表明该方法重现性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批次百蕊草药材(ZP1)6份，每份各约1.0 g，分别按照“2.1”所述方法测定供试品中各色谱峰的保留时间，其相对标准差RSD均小于1%，表明本方法重现性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一批次供试品溶液(ZP1)，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按上述色谱条件进样20 μL，记录色谱图和各成分峰面积。供试品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的平均峰面积分别为60 113 235.041、1 596 611.503、45 202.100，RSD(n=6)分别为0.93%、2.12%、1.32%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 称取已知含量的百蕊草药材粉末6份，每份约0.5 g精密称定，精密加入浓度分别为1.500 mg/mL、1.000 mg/mL、1.000 mg/mL的对照品溶液1.0 mL，依据“2.3”所述方法制成供试品溶液，测定百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的含量，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果 (n=6)

2.5 样品含量测定

取10批百蕊草药材，栽培与野生品各5批(批号：YS1、YS2、YS3、YS4、YS5；ZP1、ZP2、ZP3、ZP4、ZP5)，按照“2.3”所述方法制备供试品溶液。对照品溶液和供试品溶液各进样20 μL测定，记录峰面积。采用外标法分别计算10批百蕊草栽培与野生品药材中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的含量，结果见表3。

表3 百蕊草中3种成分含量测定结果 (n=10)

3 讨论

研究表明，黄酮类化合物、有机酸、生物碱等活性物质是百蕊草抑菌作用的主要物质基础，以黄酮的抑菌活性最强[7-8]。山柰酚作为最常见的黄酮类化合物，具有显著的抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒作用，是百蕊草发挥药效的主要成分，目前多以山柰酚、百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ的含量作为百蕊草药材品质控制的主要指标[9-10]，百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ作为百蕊草特有成分，含量较高。因此，本研究选择山柰酚、百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ作为测定指标，可以较全面地反映百蕊草野生和栽培药材质量。

本研究以百蕊草栽培和野生药材为研究对象，采用外标法对两者的3种活性成分进行测定，结果表明百蕊草野生品与栽培品中3种成分含量差异较大。以百蕊草素Ⅰ为例，百蕊草栽培品的含量是其野生品的将近2倍，但野生品的紫云英苷含量为栽培品的4.8倍，山柰酚在百蕊草药材中含量较低，其含量在百蕊草栽培和野生药材中差异显著，野生百蕊草药材山柰酚含量为其栽培品14.33倍，因山柰酚为百蕊草黄酮苷类成分的水解产物，其含量高低受外界环境条件影响[11]，百蕊草素Ⅰ和紫云英苷的含量在栽培品和野生品中差异显著，由于中药药理作用的发挥并不依赖于单一化学成份，而是多种活性成分共同作用的结果。这些结果提示：基于目前的质量评价标准，百蕊草栽培药材还不能达到药用要求，百蕊草栽培品与野生品质量尚缺乏一致性，百蕊草野生变家种或野生培育还需进一步研究[12-13]。