章晓乐，王敏燕，梁程程，杨梦琪，蔡静雯，齐聪*

(上海中医药大学附属曙光医院 1.妇产科；2.病理科，上海 201203)

宫腔粘连(Intrauterine adhesion，IUAs)多由于宫腔内手术操作不当或过度操作导致子宫内膜损伤而引起[1]，发病率呈逐年增高的趋势[2]。子宫内膜损伤后体内相关炎性因子上调，诱导并促进在位子宫内膜干细胞分化，对子宫内膜的修复起到积极作用[3]。但若患者内膜损伤严重且存在感染等因素时，基底层完整性缺损，部分内膜缺血、对雌激素不应答，活性氧异常蓄积，导致内膜微环境发生相应改变，形成大量纤维组织继而出现IUAs[4]，甚至于导致不孕症发生。

从中医角度研究，IUAs患者证候特点属于月经量少、闭经、不孕症的范畴。病机多为肾虚血瘀，而补肾活血方具有活血化瘀、补肾填精以生新之功效。前期有临床研究发现，应用补肾活血方可改善IUAs分离术后的子宫内膜厚度，有效缓解反复移植失败，提高临床妊娠率[5]。故本研究采用机械损伤加感染的方法建立IUAs模型大鼠，从子宫内膜病理形态变化及胞饮突的影响，拟探讨补肾活血方促进IUAs修复的作用。

材料与方法

一、实验动物与分组

选取清洁级性成熟未孕雌性8～10周龄SD大鼠70只，每只大鼠体重约220～250 g，性周期4～5 d。实验动物由上海中医药大学实验动物中心提供[合格证编号20170005015466，许可证编号SCXK(沪)2017-0005]。本研究通过上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查(伦理编号PZSHUTCM190912003)。

实验SD雌性大鼠进行适应性饲养后，按随机数字表法分为4组：空白对照组及模型对照组各20只，补佳乐组和补肾活血组每组各15只。

二、药物制备及剂量

1.补肾活血方：由上海中医药大学附属曙光医院门诊中药房配制，成分：鹿角片9 g、菟丝子15 g、巴戟天15 g、熟地黄12 g、黄芪30 g、当归15 g、牛膝18 g、川芎9 g、水蛭15 g、炙甘草6 g。实验剂量：补肾活血方人的临床用药剂量为18 g/d，根据“人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表”[6]得出200 g大鼠与70 kg人折算系数为0.018，因此计算出大鼠补肾活血方的等临床剂量为1.62 g/kg。将补肾活血方制成浓度为1.5 g/ml混悬液，保存于4℃冰箱，每日称重大鼠体重，计算相应补肾活血方混悬液剂量进行灌胃。

2.补佳乐：补佳乐(戊酸雌二醇片)购自拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20130009，规格1 mg/片。根据“人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表”，人的临床用药剂量为2 mg/d，计算出大鼠补佳乐的等临床剂量为0.18 mg/kg。使用前将补佳乐研磨成粉，用0.9%生理盐水以0.18 mg：10 ml的比例制成混悬液，放置于4℃冰箱保存，每日称重大鼠体重，计算相应补佳乐混悬液剂量进行灌胃。

三、实验方法

1.造模方案：模型对照组、补佳乐组及补肾活血组均参照文献[7]进行造模，建立子宫内膜腔双重损伤模型(机械刮宫+细菌脂多糖感染)。对处于动情期的体重220 g左右雌性SD大鼠(动情期鉴定：大鼠阴道涂片显微镜下显示片状多角上皮细胞)给予10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，给药剂量按照0.4 ml/100 g计算。麻醉后，将大鼠仰卧位固定于手术板上，备皮、消毒，距耻骨联合上约1 cm下腹部正中切开，切口长约2.5 cm，逐层进入腹腔，暴露右侧子宫角，于距离卵巢0.5 cm处，剪出长约3 mm平行于子宫长轴的切口，直径2.5 mm微型刮匙，反复来回搔刮大鼠宫腔前后左右4个不同方向，子宫四壁有毛糙感时停止。将子宫角上的切口缝合，之后将直针(已穿好3号细菌脂多糖手术丝线)穿过右侧宫腔，置留约2 cm长丝线于宫腔中，回纳右侧子宫腔；同样方法进行左侧宫腔操作。0.9%生理盐水冲洗腹腔2次，之后逐层缝合腹壁及皮肤。

2.空白对照组大鼠处理：参考文献[8]操作，麻醉、开腹操作同造模大鼠，宫角充分显露于体外后回纳，不采取其余操作，予0.9%生理盐水冲洗腹腔2次，之后逐层缝合腹壁及皮肤逐层关腹。

所有大鼠苏醒前均注意保温以防术后体温过低导致死亡，连续3 d予青霉素肌肉注射抗感染，用量为200 000 U/d。大鼠麻醉清醒后正常饲养，观察其饮食和活动情况。

3.各组的干预方案：(1)空白对照组和模型对照组：手术完成1周后，使用蒸馏水灌胃，给予剂量按0.1 ml·kg-1·d-1计算，连续灌胃至取材，合笼雌鼠连续灌胃3个动情周期，每个周期5 d；(2)补佳乐组：模型制备1周后，按照前述药物浓度根据大鼠体重给予补佳乐混悬液灌胃，灌胃持续时间同前；(3)补肾活血组：模型制备1周后，按照前述药物浓度根据大鼠体重给予补肾活血方混悬液灌胃，灌胃持续时间同前。

4.取材：空白对照组及模型对照组造模7 d后颈椎脱臼法各处死5只大鼠，取材用以验证造模效果。其余大鼠灌胃处理后第10天(造模后第17天)，颈椎脱臼法处死每组10只雌鼠，取材用于相关实验。开腹操作同造模，剥离子宫角壁上的系膜，剪开输卵管和子宫，获取一角全部子宫标本。PBS缓冲液冲洗一角子宫标本后投入3%戊二醛中固定5 min，切分成0.5 cm×0.5 cm大小的6～7块，浸泡于4%多聚甲醛液中固定备用。剩余对侧一角子宫保存于液氮中以备后续试验使用。

每组剩余5只雌鼠与雄鼠以2∶1的比例合笼，次日晨8∶00进行阴道涂片，观察阴道脱落细胞了解受精情况，见阴栓者记为妊娠第1天。在妊娠第5天的19时从尾静脉注射0.5%伊文思蓝0.1 ml，15 min后用颈椎脱臼法处死大鼠，开腹，根据子宫的嗜色反应判断着床部位(着床位点着色显示蓝色)，记录各组妊娠鼠数和孕鼠着床点数。一角子宫纵向切开，留取部分子宫组织，避光保存于2.5%戊二醛中以备扫描电镜观察。

5.HE染色：取出固定1周后的子宫标本，进行石蜡包埋、切片、HE染色，脱水封片。在光镜下观察大鼠子宫内膜腺体、血管分布情况、腔上皮或腺上皮细胞形态学变化。子宫内膜厚度采用ImageJ图像处理软件测定。

低倍镜(×10)下子宫内膜厚度测量的具体方法：测量子宫内膜肌层交界处至宫腔的垂直距离，每组取3张切片，每张切片随机取4个视野，计算平均值。高倍镜(×100)下计数腺体数目：通过HE染色，每组取3张切片，每个切片随机取4个视野，观察并计算子宫内膜腺体数量。

6.扫描电镜观察子宫内膜形态学变化：SD大鼠子宫样本在2.5%戊二醛溶液中固定2～3 h(4℃)后，取出，用pH7.4 PBS冲洗3次(共3 min)，1%锇酸固定3 h(4℃)。用0.1 mol/L PBS冲洗3次，每次冲洗5～10 min，再经梯度酒精脱水(酒精浓度依次为30%、50%、70%、90%、100%)、真空干燥、喷金。于上海中医药大学电镜室进行扫描电子显微镜下观察子宫内膜结构和胞饮突形态。

四、统计学分析

结 果

一、各组大鼠子宫内膜HE染色组织学观察

各组大鼠子宫内膜HE染色镜下特点各有不同(图1)。空白对照组：大鼠子宫结构完整，从内至外分为：内膜层、肌层、浆膜层；宫腔面积大，内膜层分为上皮层和间质，上皮层为单层柱状上皮细胞；内膜层血管及腺体丰富，子宫内膜均匀。模型对照组：与空白对照组相比，宫腔残余面积减少，子宫内膜厚薄不均，整体变薄，子宫内膜间质细胞、腺体及血管明显减少、稀疏、无活性，间质可见大量纤维组织增生，囊样扩张。补肾活血组：较模型对照组宫腔残余面积明显增大，子宫内膜间质细胞、腺体及微血管增多，子宫内膜间质未见明显炎性细胞浸润，可见新生血管及呈簇状存在的腺体。补佳乐组：同补肾活血组相似，可观察到损伤的内膜恢复现象，宫腔残余面积较模型对照组明显增加，间质部出现较模型对照组多的腺体，部分毛细血管内见微小栓子。

表示腺体 ↓表示血管

二、各组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量比较

各组内膜厚度数据服从正态分布，满足方差齐性，统计学分析发现各组间内膜厚度比较有显著性差异(F=16.49，P<0.01)。空白对照组内膜最厚，补肾活血组次之，再次为补佳乐组，模型对照组最薄。补肾活血组、补佳乐组的内膜厚度显著大于模型对照组(P<0.05)，补肾活血组的内膜厚度显著大于补佳乐组(P=0.02)(表1)。各组大鼠子宫内膜腺体数量组间比较亦有显著性差异(F=26.75，P<0.01)，空白对照组最多，补肾活血组次之，模型对照组最少；补肾活血组腺体数量显著高于补佳乐组(P=0.002)。

表1 各组大鼠内膜厚度比较

三、各组大鼠胚胎着床数比较

空白对照组、模型对照组、补肾活血组、补佳乐组每组进行合笼的5只大鼠均妊娠。各组大鼠着床数组间比较有显著性差异(F=26.88，P<0.01)，空白对照组最高，补肾活血组次之，再次为补佳乐组，模型对照组最低(P<0.05)；补肾活血组着床数显著高于补佳乐组(P<0.05)(表2)。

表2 治疗后胚胎着床数比较

四、扫描电镜观察子宫内膜形态变化

各组大鼠电镜下观察到的内膜形态特点不同(图2)。空白对照组：扫描电镜下见明显发育成熟的胞饮突，表面光滑，覆盖微绒毛，长绒毛消失。模型对照组：扫描电镜下见子宫内膜表面绒毛稀疏、破坏严重，部分绒毛见缺损，可见少量小胞饮突表达。补肾活血组：扫描电镜下见胞饮突高度低于绒毛，胞饮突正在发育阶段，仅见个别成熟胞饮突，绒毛较为光滑。补佳乐组：扫描电镜下见胞饮突正在发育阶段，未完全成熟，部分胞饮突发育不饱满，发育程度差，绒毛结构不清晰，表面粗糙。

图2 各组大鼠子宫内膜电镜下扫描所见(×10 000)

讨 论

本研究中使用的补肾活血方(又名宫腔I号方)是上海市名中医齐聪教授治疗子宫内膜损伤(如宫腔粘连等)导致不孕症、月经量少的经验方。补肾活血方的组成及功效为：鹿角片(9 g)为血肉有情之品，与菟丝子(15 g)、熟地黄(12 g)、巴戟天(15 g)联用补肾填精；黄芪(30 g)补气以助血行，水蛭(15 g)作为全方之引药，其走窜之性，引药入胞宫，与当归(15 g)、牛膝(18 g)、川芎(9 g)联用，补血活血，引血下行通络；炙甘草(6 g)调和诸药，全方阴阳并补、动静结合，共奏补肾活血之功效。之前研究发现，应用补肾活血方结合IUAs分解手术，能明显提高IUAs导致反复移植失败患者的临床妊娠率[5]。

本研究采用感染和机械刮宫双重损伤建立动物模型，该造模方式与人类子宫内膜损伤过程相似。双重损伤造模过程中发现，造模第7天子宫内膜完整性被破坏，间质纤维增多，粘连形成，导致宫腔失去正常形态，提示选用SD大鼠建立IUAs模型用于探索IUAs的发病机制是可行的，也再次验证了之前文献[6]的观点。

感染和机械刮宫双重损伤后，HE染色观察发现，模型对照组中宫腔残余面积减少，子宫内膜厚薄不均，整体变薄，子宫内膜间质细胞、腺体及血管减少明显、稀疏、无活性，间质可见大量纤维组织增生，囊样扩张。子宫内膜粘连的组织病理学特征通常是以无血管或血管薄壁、扩张的毛细血管为特征[9]。模型对照组宫腔形态改变符合IUAs的病理变化，提示该模型可以模拟IUAs疾病的临床及病例特点。

合适的子宫内膜厚度能够为胚胎的植入提供优良的“土壤”，是确保妊娠结局良好的关键条件。对子宫内膜的厚度进行评估，是衡量子宫内膜损伤后修复的重要指标[10]。对造模大鼠分别予以补肾活血方、补佳乐干预治疗后，通过HE染色，对损伤后大鼠内膜厚度进行观察，并与模型对照组进行比较，发现治疗组子宫内膜厚度均有显著增加的趋势(P<0.05)，且补肾活血组内膜厚度显著大于补佳乐组(P<0.05)。有研究认为，补肾活血方联合西药治疗可以改善子宫内膜血流灌注情况，增加胚胎着床日内膜厚度[11]。廖慧慧等[12]研究发现，给予补肾中药成分治疗可上调损伤后子宫内膜血管内皮生长因子受体及孕激素受体的表达，促进损伤后子宫内膜组织对激素的应答，有利于子宫内膜增厚。本研究结果再次证实，宫腔操作手术后给予补肾活血中药治疗，因其补肾填精之功效，能调动子宫在位内膜增生，对子宫内膜损伤修复具有积极意义。

子宫内膜损伤后可导致内膜变薄，内膜腺体及间质出现萎缩，内膜逐渐瘢痕化。子宫内膜腺体数量可作为评价子宫内膜损伤后修复及再生的指标[13]。本研究对内膜基质层腺体数量进行观察发现，模型对照组腺体数量明显减少，补肾活血组与补佳乐组较模型对照组均显著增加，且补肾活血组腺体数量增多显著高于补佳乐组(P<0.05)，提示补肾活血方可有效促进损伤子宫内膜中的腺体数量恢复，可能有助于改善内膜微环境。

胞饮突是子宫内膜“种植窗”开放的重要标志物，是评估子宫内膜容受性的微观标志物。胞饮突在分泌期时位于子宫内膜微绒毛细胞顶部，成熟的胞饮突电镜下呈现表面光滑的蘑菇状凸起。成熟的胞饮突可增加胚胎与内膜的接触面积，促进其粘附及着床[14-15]。研究证实，妊娠第4天起大鼠子宫内膜中的胞饮突数量增加，第5天达到峰值，植入后期其数量呈下降趋势[16]。本研究于妊娠第5天取材观察大鼠内膜胞饮突状态，发现模型对照组SD大鼠宫腔微绒毛结构紊乱稀疏，胞饮突发育缓慢；给予补肾活血方能使胞饮突附着部位的微绒毛结构相对完整，胞饮突饱满，内膜突起表面光滑，接近于成熟；补佳乐组胞饮突结构也有所恢复，但绒毛结构相对不清晰，胞饮突发育程度差。提示补肾活血方能更好地促进胞饮突成熟和绒毛结构完整，改善子宫内膜容受性，有助于胚胎定位、黏附。后续研究中可以对胞饮突的数量进行量化比较，以进一步验证补肾活血方改善子宫内膜容受性的疗效。

本研究结果显示，补肾活血组、补佳乐组与模型对照组相比，妊娠大鼠的着床数显著增加，且补肾活血组着床数显著高于补佳乐组(P<0.05)，但均不及空白对照组(P<0.05)。提示宫腔内膜损伤会降低内膜容受性，影响胚胎着床。给予补肾活血方和补佳乐治疗均能一定程度改善大鼠受损子宫内膜的容受性，有利于受精卵植入及胚胎发育，且补肾活血方效果更佳，这可能与传统补肾填精类中药具有一定雌激素功效，可以提高雌激素受体水平，改善子宫内膜厚度及内膜容受性的作用有关[17]。同时活血化瘀类中药能够扩张血管，促进微循环，有利于损伤内膜的容受性恢复[18]。

综上所述，本研究采用感染和机械刮宫双重损伤成功建立动物模型，并探讨造模后给予补肾活血方干预子宫内膜形态的改变。研究结果提示，补肾活血方能有效改善子宫内膜厚度，促进内膜中腺体数量恢复及胞饮突发育，有利于胚胎着床。后续研究可以检测子宫内膜损伤后采用补肾活血方治疗内膜中相关细胞因子、激素受体等指标的变化，以进一步探讨补肾活血方促进子宫内膜修复的具体机制。