罗梓瑜 董伟群

自2016年，国家全面开放“二孩”以来，人们的生育意愿得到了政策支持。今年“三孩”生育政策逐步落地，随着新生人口的激增，围产期母婴安全又提到了新的高度。反复多次的妊娠可能会导致母体产生针对胎儿血小板抗原的抗体，并由此引发不良妊娠、胎儿及新生儿同种免疫性血小板减少症（fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia,FNAIT）等疾病。

随着对不良妊娠以及FNAIT病理生理的研究发现，人类血小板抗原（HPA）经同种免疫所产生的血小板特异性抗体是造成不良妊娠以及FNAIT的重要原因。既往的研究显示不同人种、地区以及民族间的HPA基因频率具有差异，因此了解本地区HPA基因分布频率、分布特点，对降低相关疾病的发病率具有重要意义。本文针对研究显示与不良妊娠和FNAIT相关的HPA1-5系统的基因型在云南地区的分布情况进行检测分析。

资料与方法

1 研究对象 a：2020年1月1日～2021年7月31日间收集576名健康志愿者进行血小板HPA1-5基因分型。因云南地处少数民族聚集地区，故捐献者中包括汉族150例、景颇族148例、阿昌族139例、傣族139例，所有研究对象间三代内无血缘关系，无外族通婚情况，并获院伦理委员会审批履行知情告知；b：为了解地区内育龄女性血小板抗体阳性率，对同期来我院就诊的产科和生殖遗传科患者中，随机选择630例进行血小板抗体检测与抗体鉴定，并通过电子病历系统查询患者一般临床资料，研究对象除妊娠或生殖系统疾病以外无其他合并疾病。

2 样本采集 每人抽取EDTA-K2抗凝静脉血3 mL，于-80℃保存待检，用于血小板抗原基因分型；血小板抗体筛查以及血小板抗体鉴定标本为EDTA-K2抗凝静脉血，分离血浆后，按预定检测时间分别保存在＜-18℃或-80℃。

3 仪器与试剂 PCR扩增仪、水平电泳仪（美国Bio-Rad公司），凝胶成像系统：Bio-Rad公司Gel Doc EQ凝胶成像系统；血小板抗原基因分型试剂盒（长春博德生物技术有限公司）；血小板抗体检测试剂盒（荷兰Sanquin），MASPAT指示红细胞（荷兰Sanquin），MASPAT血小板悬液（荷兰Sanquin），PBS溶液（上海博古生物）血小板抗体鉴定试剂盒PAKPLUS微孔板试剂盒（美国GTI公司），恒温酶标仪(TECAN)，磷酸氯喹溶液。

4 DNA提取 利用碘化钾法，紫外分光光度计测定提取的基因组DNA的紫外吸收峰，在波长260 nm、280 nm分别测定吸光度，计算DNA浓度与纯度。稀释成1 μg/μL-20℃储存。

5 HPA基因分型 包括PCR引物混合物（序列特异性引物0.4 μmol/L，内参引物0.4 μmol/L）、10×PCR Buffer5 μL、dNTP0.2 mmol/L，Taq酶0.75 U和基因组DNA 1μg，在同一条件下对HPA1-5系统同时进行扩增。反应条件：94℃、9 min；94℃、1 min；61℃、1 min；72℃、1 min；共35个cycle；最后72℃，10 min。

6 检测扩增产物 PCR产物10 μL在2%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）中电泳，电压80 mV，电泳时间30 min，自动凝胶成像系统观察并记录结果。

7 血小板抗体筛查 待检血浆加入反应孔中孵育，若血浆中含有血小板抗体，则该抗体与反应孔中的血小板结合，未结合的成分通过洗涤被去除，加入抗人-IgG指示红细胞，指示红细胞平铺在反应孔底部为阳性反应，指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔的底部中央为阴性反应。

8 血小板相关抗体鉴定 HPA抗体检测试剂盒包被了血小板特异性抗体（抗-HPA）和组织相容性抗体（抗-HLA-Ⅰ），其中血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa孔包被的抗原有HPA-1a/1a、HPA-3a/3a、HPA-4a/4a；HPA-1b/1b、HPA-3b/3b、HPA-4a/4a。GPⅠa/Ⅱa孔分别包被了HPA-5b/5b和HPA-5a/5a；按试剂盒说明书操作，酶标仪在405 nm读取吸光度，测定孔吸光度大于等于阴性孔读数的2倍即为阳性。

9 统计学处理 采用SPSS22统计软件，进行χ2检验，不同人群间基因频率的比较进行χ2检验(精确概率法)，基因型之间的比较采用χ2检验的多个构成比的比较。P＜0.05为具有统计学差异Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，求得观察值与期望值间的P值，以P＞0.05为符合平衡法则。各系统对偶抗原不配合概率（血小板随机输注HPA错配概率）用此公式计算MMP=a2（1-a2）+b2（1-b2）=2ab（1-ab）［12］，a、b为对偶抗原等位基因频率。

表1 阿昌族组HPA 1-5系统等位基因和基因型频率分布（n=139）

表2 景颇族组HPA 1-5系统基因和基因型频率分布（n=148）

表3 傣族组HPA 1-5系统基因和基因型频率分布（n=139）

表4 汉族组HPA 1-5系统基因和基因型频率分布（n=150）

结 果

1 云南各民族HPA基因型和等位基因频率分布 5个HPA系统中，景颇族HPA-4基因型均为aa，未检测到b等位基因；其余民族及其他HPA系统同时检测到a和b等位基因，除HPA-3系统外均以aa基因型为主。

2 云南地区各民族间基因频率比较 见表5。

表5 不同民族间基因频率的比较

不同民族间HPA基因频率的组间比较，阿昌族组HPA-1a基因频率与其他民族相比，差异有统计学意义（P＜0.05)；景颇族组的HPA-2a系统的基因频率与其他组的差异具有统计学意义（P＜0.05)；其余各组间基因频率的差异无统计学意义。

3 云南地区孕妇血小板抗体筛查情况 检测结果显示，630例患者血小板抗体检测阳性的有90例，阳性患者民族均为汉族，阳性率为14.29%，其抗体分布频率见表6。对58例HPA抗体阳性患者进行HPA抗体分类（包括单独抗-HPA抗体和抗-HLA抗体合并抗-HPA抗体阳性患者），结果见表7。

表6 90例血小板抗体阳性患者抗体分布频率

表7 58例HPA抗体分类

讨 论

孕妇产生的同种免疫性血小板抗体进入胎儿体内致敏胎儿血小板后，使致敏血小板在网状内皮系统被巨噬细胞吞噬，从而导致患儿血小板减少，是典型FNAIT的病理机制。FNAIT的发生与HPA多态性有关，产生的HPA抗体是引起FANIT的主要原因，FNAIT的主要风险是颅内出血（intracranial hemorrhage，ICH），而ICH的主要原因可能是来自母体的同种免疫性血小板抗体使患儿血管生成受损而不是血小板减少[1]。已报道引起FNAIT的抗体有抗-HPA-1a、抗-HPA-1b、抗-HPA-5a、抗-HPA-5b、抗-HPA-4b、抗-HPA-3a、抗-HPA-2a和抗-CD36等[9-11]。HPA基因分布在不同种族、不同民族、同一民族的不同人群中甚至都可能不同，其中具有临床意义的抗原也不同。

本研究对云南地区不同民族的HPA 1-5系统进行基因分型，结果显示，除景颇族HPA-4基因型均为aa，未检测到b等位基因外，其余基因座位均符合Hardy-Weinberg平衡。在我们所检测的5个系统中，其中对偶抗原不配合概率最高的系统为HPA-3系统，这与先前其他地区的研究数据一致，猜测抗-HPA-3a抗体所导致的FNAIT和流产，是本地区需要重点关注的对象。在欧美地区绝大多数FNAIT由HPA-1系统的抗-HPA-1a引起[3-4]，该系统阿昌族组基因频率与其他组相比存在差异，猜测云南地区阿昌族产生致病抗体的可能性高于其他民族。景颇族组的HPA-2系统的基因频率与其他组的差异具有统计学意义，地区内景颇族患抗-HPA-2a抗体引起的典型及非典型[2]的FNAIT的风险可能高于其他民族。同属于亚洲人群的日本，引起FNAIT最常见的抗体是抗-HPA-5b，其次为抗-HPA-4b[4-5]。在我们的研究中，景颇族组HPA-4系统未检测到b等位基因，所以在景颇族中产生抗-HPA-4b抗体的可能性相对较低。对于HPA-5系统的研究显示，汉族组MP显著低于其他民族组，对地区内不同民族的致病性抗体研究具有重要意义。

本地区育龄妇女血小板抗体阳性率为14.29%，高于国内相关报道（8.1%）[6]。分析原因可能为纳入研究的病例有部分生殖遗传科病人，本身就存在有不良孕产史或者多次妊娠的情况，故血小板抗体阳性率稍高，也进一步提示血小板抗体检测对研究反复流产病因、早期预测及预防FNAIT的发生有重要作用。且存在一部分HPA抗体和HLA抗体共同存在的情况，抗-HPA抗体不论是单独存在还是和抗-HLA抗体一起检出都具有临床意义[13]。在HPA抗体的分类中发现，GPⅡb/Ⅲa孔阳性率较高，阳性孔表达抗原为HPA-1a/1a、3a/3a、4a/4a；HPA-1b/1b、HPA-3b/3b、HPA-4a/4a，虽因客观条件限制未能对所有的HPA抗体阳性的病人进行基因分型，但根据云南汉族人群HPA1-5系统的基因多态性分析，HPA-3是杂合度最高的系统，推测这部分阳性病例的HPA抗体类型很有可能为抗-HPA-3系统的抗体。虽然汉族组的HPA-5系统MP值低于其他民族组，但GPⅠa/Ⅱa孔阳性占到一定比例，提示出现抗-HPA-5系统的致病性抗体，虽然从基因频率分析，汉族出现抗-HPA-5系统抗体的概率低于其他组，但在多民族聚集地区不同民族间的通婚现象对基因多态性有一定影响，在研究血小板抗体对反复流产及FNAIT的影响时需对患者的一般资料进行详尽的分析。

在血小板鉴定的后续研究中，因条件限制未能对血小板抗体的特异性进行更近一步的鉴定，仅能利用现有的数据进行推测，抗体的特异性和HPA基因频率的关系有待更深入的研究，以及对地区内其他民族的HPA基因多态性的研究还有很大的空白，是本研究的不足之处。

对分娩过FNAIT患儿或有过不明原因自然流产史的孕妇进行血小板相关抗体筛查，可以预测FNAIT的风险。母体循环血液中检出靶向胎儿（或新生儿）血小板抗原的抗体是诊断FNAIT的重要依据[3]，FNAIT患儿血液中也可能检出与其母亲血液中相同的特异性靶向患儿血小板抗原的抗体。FNAIT患儿母亲再次妊娠时发生FNAIT的概率取决于生物学父亲携带的与胎儿母亲血小板抗体靶向抗原的基因型。如胎儿生物学父亲携带的抗原基因为纯合子，FNAIT的发生率接近 100%，如胎儿生物学父亲携带的抗原基因为杂合子，则FNAIT的发生率为50%[8]。

血小板特异性抗原所产生的血小板特异性抗体，是造成孕早期流产，胎儿出生后罹患FNAIT的重要原因。由于HPA具有遗传多态性，不同地区引起FNAIT的主要HPA类型也有差异。了解不同地区HPA基因频率的差异，不仅有助于预测该地区人群患FNAIT的风险，并且可以为建立血小板供者HPA资料库奠定基础。

云南地处少数民族聚集地区，不同民族间有通婚现象，因此对HPA基因多态性的研究，更有助于阐明引起本地区人群引起不良妊娠以及FNAIT等疾病的主要HPA抗体，协助疾病的预防、诊断及治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突