兔卵巢颗粒细胞分离培养条件的优化

2021-12-17靳荣帅白少成吴信生

中国畜牧杂志 2021年12期

靳荣帅，陈实，周娟，白少成，张琛，姚凡，陈阳，吴信生

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225000）

卵巢颗粒细胞存在于雌性动物卵泡腔内，一般颗粒细胞可分为两大类，一类是包裹在卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞，一类是排列在卵泡壁上的壁层颗粒细胞[1]。包裹卵母细胞的卵丘颗粒细胞会在排卵前发生扩散，排卵后壁层颗粒细胞会发生黄体化形成粒黄体细胞，之后与膜细胞形成黄体，这一过程对维持妊娠至关重要。卵泡的发育及排卵依赖于卵巢颗粒细胞和卵母细胞之间的高度协调发育，而这种高度协调发育主要通过2 种细胞之间持续、复杂、双向的信号交流完成[2-3]。卵丘颗粒细胞与卵母细胞之间通过微绒毛形成缝隙连接，2 种细胞通过缝隙连接完成营养物质、初级代谢产物和一些信息分子的传递，进而促进2 种细胞的生长和分化，使两者达到高度协调发育[4-5]。此外，卵母细胞无法有效利用葡萄糖产生能量，只能利用颗粒细胞代谢产生的羧酸进行氧化磷酸化反应产生发育所需的能量[3,6]。也有研究表明卵丘颗粒细胞所产生的丙酮酸可为卵母细胞发育提供重要的支持[7-8]。因此，兔卵巢颗粒细胞对卵母细胞的成熟及卵泡的正常发育都有着至关重要的作用。

在前期研究中，利用含10%胎牛血清的DMEM 培养基进行原代兔卵巢颗粒细胞培养，发现细胞生长增殖速度较慢。为优化兔卵巢颗粒细胞体外培养体系，本实验在体外分离鉴定了兔卵巢颗粒细胞，并优化了培养条件，为卵巢颗粒细胞在体外调节卵母细胞发育和代谢等后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验选择4～6 月龄性成熟新西兰白兔母兔，由扬州市某兔场提供。

1.2 实验试剂胎牛血清为Gibco 产品（A31610-01）；DMEM/F-12 基础培养基为Hyclone 产品（AF29527017）,DMEM 基础培养基为Hyclone 产品（C11885500BT）；双抗（青链霉素混合液100×）,TritonX-100，4%组织细胞固定液均为索莱宝公司产品；Anti-FSHR 抗体为Affinity 产品；羊抗兔IgG H&L（FITC）为Abcam 产品。

1.3 兔卵巢颗粒细胞分离准备2 只4～6 月龄的新西兰白兔母兔，每只肌肉注射孕马血清促性腺激素（PMSG）80 IU，6 h 后用耳缘静脉栓塞法处死兔子。为保证卵巢在运输过程中保持新鲜，将兔子双侧卵巢放入预冷的PBS（含1%双抗，pH 为7.4）中，带入细胞间。首先将采集的卵巢组织放置于无菌培养皿（60×15 mm）中，用PBS 清洗2 遍。将卵巢组织放入加有双抗（100 IU/mL青霉素和链霉素）的DMEM（高糖）培养液的无菌培养皿中，用1 mL 注射器针头刺破卵巢表面的卵泡，使卵泡内容物释放于其中。然后用200 目不锈钢细胞筛过滤。收集到的滤液1 000 r/min 离心5 min，弃上清。向沉积在离心管底部的细胞团加入2 mL 红细胞裂解液，裂解5 min 后1 000 r/min 离心5 min，弃上清液。向沉积在离心管底部的细胞团加入DMEM（含10%胎牛血清1%双抗）制成细胞悬液，细胞悬液接种到6 孔板中，在5%CO2，37.0℃条件下孵育24 h。

1.4 免疫荧光法鉴定兔卵巢颗粒细胞针对卵泡刺激素受体（Follicle-Stimulating Hormone Receptor，FSHR）在颗粒细胞中特异性表达的特点，采用细胞免疫荧光法对体外培养的颗粒细胞进行鉴定。首先吸除培养24 h 后的原代颗粒细胞旧培养基，用PBS 清洗3 次，每次5 min。4%多聚甲醛固定液室温固定30 min。PBS 漂洗3 次，每次5 min。0.3% TritionX-100 处理60 min，PBS 洗3次，每次5 min。1% BSA 室温封闭60 min。吸出封闭液，不洗。吸弃封闭液，加入一抗（anti-FSHR，1:250），4℃孵育过夜。PBST 漂洗3 次，每次5 min。将1:2000比例稀释好的FITC 二抗滴加其中，37℃孵育60 min。PBST 漂洗3 次，每次5 min。滴加DAPI，室温染色10 min 左右。荧光显微镜下观察显色，拍照保存。

1.5 兔卵巢颗粒细胞培养 DMEM 和DMEM/F-12 培养基都是细胞培养常用的培养基。前期在原代兔卵巢颗粒细胞培养过程中首先使用了含10%胎牛血清的DMEM培养基，发现细胞生长速度较慢，推测有可能是因为血清浓度和培养基不合适所致。因此，本实验分别用血清浓度为5%、10%、15% 的DMEM/F-12 培养基培养兔卵巢颗粒细胞，以期获得最适合兔卵巢颗粒细胞生长的培养基和血清浓度。

1.6 CCK-8 检测细胞增殖状况细胞在24 孔板内培养48 h 后，将细胞分别接种于4 个96 孔板内以检测0、24、48、72 h 时的细胞增殖状况。待细胞贴壁后吸出培养基。由于2 种培养基颜色不同，会影响吸光值，因此弃掉原培养基后加入100 μL 的DMEM/F-12 培养基，在每孔内分别加入10 μL 的CCK-8 溶剂，放入细胞培养箱孵育4 h，放入酶标仪测量吸光值A450，记为0 h。以后每24 h 用同样的方法测量1 次，共4 次。最后，以吸光值为纵坐标、时间为横坐标绘制细胞生长曲线。

1.7 统计分析细胞增殖的数据处理及增殖折线图的绘制均使用GraphPadPrism8 软件进行。

2 结果

2.1 兔卵巢颗粒细胞分离与鉴定如图1 所示，体外分离培养24 h 后，兔卵巢颗粒细胞呈单层贴壁性增长，形态为不规则的多边形。利用卵巢颗粒细胞特异性蛋白FSHR 进行免疫荧光检测，发现视野中呈现绿色荧光，证实分离的细胞为颗粒细胞（图2）。

图1 兔卵巢颗粒细胞形态图

图2 免疫荧光染色图

在细胞鉴定完成后，对卵巢颗粒细胞进行传代培养，结果如图3 所示，可以明显观察到颗粒细胞出现分化。

图3 第2 代兔卵巢颗粒细胞形态图

2.2 不同浓度血清和培养基对细胞生长状态的影响在DMEM 和DMEM/F-12 培养基中分别加入5%、10%、15%的胎牛血清，在卵巢颗粒细胞接种密度一致的前提下，培养48 h 后细胞生长情况如图4 所示，随着血清浓度增加2 种不同培养基中细胞汇合度都在不断增加，其中在含有15% 血清的DMEM/F-12 条件下培养的细胞汇合度最高，可达60%左右。

图4 不同血清浓度和培养基下细胞生长状况

2.3 不同浓度血清和培养基对细胞增殖的影响如图5所示，在加入15% 血清的DMEM/F-12 条件下细胞增殖速度最快。在5%血清条件下，培养72 h 后DMEM/F-12 组细胞增殖效果高于DMEM 组（P＜0.05）；在10%血清条件下，DMEM/F-12 组细胞增殖效果在48 h时高于DMEM 组（P＜0.05），在72 h 时极显著高于DMEM 组（P＜0.01）。在3 种不同血清浓度条件下，DMEM/F-12 组细胞的增殖情况均优于DMEM 组。

图5 不同血清浓度和培养基下细胞增殖状况

3 讨论

卵泡颗粒细胞可分为围绕卵母细胞的卵丘细胞和围绕卵泡壁的壁颗粒细胞。其中，壁颗粒细胞的主要功能是参与细胞分化和信号转导，卵丘细胞的主要功能是参与细胞增殖和代谢[9-10]。排卵后颗粒细胞会分化为黄体细胞，并分泌孕酮来调节卵巢的功能[11]。在体内，卵母细胞在发育过程中很难吸收利用氨基酸，只能通过缝隙连接利用由卵丘细胞摄取的氨基酸，即颗粒细胞间接促进了卵母细胞代谢的完成[8]。在体外培养过程中，一定浓度的颗粒细胞可以提高受精卵的发育能力[12]。此外，颗粒细胞上具有FSH 受体和雌激素受体，分别可以和FSH 与雌激素相结合产生多种信号分子，从而促进卵母细胞生长、颗粒细胞增殖及卵泡发育成熟和排卵[9]。可见，颗粒细胞既是卵泡的重要组成部分，也是影响卵巢功能的核心单位。

在细胞培养研究领域，大多数研究都采用DMEM和DMEM/F-12 两种基础培养液[13-17]。血清中含有大量的蛋白质、脂肪等营养物质和一些促生长因子，有研究使用添加10%胎牛血清的DMEM 培养基对小鼠颗粒细胞进行体外培养，结果得到的颗粒细胞纯度高、增殖能力强[17]。此外，在猪[14]、牛[15]、鹿[18]卵巢颗粒细胞细胞体外培养液中，均有研究者添加了血清且细胞增殖状况良好。在实验过程中综合多种因素，首先采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培养基对兔颗粒细胞进行体外培养，为下一步细胞鉴定实验做准备。FSHR 仅存在于卵巢颗粒细胞上[19-20]，因此可以通过测定FSHR 蛋白的表达水平来鉴定兔卵巢颗粒细胞。本实验中，兔卵巢颗粒细胞经免疫荧光染色后，其胞质呈现绿色荧光，说明细胞上的FSHR 已经与FSHR 抗体相结合了，而被DAPI 染色的细胞核则呈蓝色。

在体外培养条件下，本实验中含有15% 血清的DMEM/F-12 条件下细胞数量最多，生长状况最好。而高亚可[11]研究表明最适合水牛卵巢颗粒细胞体外培养的条件为含有10%血清的DMEM 培养液，与兔有所不同。这也说明了不同动物卵巢颗粒细胞对培养基的要求有所不同。为了更准确地探究不同条件下颗粒细胞的增殖效果，实验采用CCK-8 法对细胞活性进行检测。其原理是通过酶标仪测量该细胞液的吸光度值,便可检测出待测细胞样品的活性[21-22]，由此便可知细胞的增殖状况。本研究中，DMEM 培养液中的细胞在任何血清浓度下的增殖效果都优于DMEM 中培养的细胞，并且在10%血清浓度下有极显著差异；此外，随着血清浓度增加，OD 值也在不断增加，并在15%血清浓度下趋于平稳。这进一步说明了含有15% 血清的DMEM/F-12 培养基更适合兔卵巢颗粒细胞的体外培养。