刘佳慧，姜希卿，张琪，王博琳，张吉龙，金君学*，孙婧陶*

（1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030）

多精受精是指受精过程中，有2个或2个以上精子进入卵母细胞的现象。与体内受精相比，体外受精时多精受精的发生率增高，导致早期胚胎死亡、发育异常/阻滞等现象发生。猪物种在体外环境下多精受精发生率高达50%～90%，是研究多精受精的理想模型。卵母细胞成熟包括核成熟和质成熟。第二次减数分裂中期第一极体排出是核成熟的标志。胞质成熟是指各种细胞内事件，如能量调节、蛋白质累积、细胞器（皮质颗粒、高尔基体）重排等。然而，在卵母细胞体外成熟过程中，细胞核率先成熟，卵母细胞质成熟的延迟使皮质颗粒的迁移及胞吐受到抑制，导致多精受精发生。因此，通过改善卵母细胞的质成熟将有效地抑制多精受精。

褪黑素作为一种强抗氧化剂，在卵母细胞体外成熟过程中可降低活性氧水平，保护卵母细胞免受氧化损伤的侵害；同时，还可以促进卵母细胞脂质代谢、改善线粒体功能，从而有效改善卵母细胞体外成熟的效率。然而，迄今为止，关于褪黑素在猪卵母细胞多精受精中的作用鲜有报道。本研究拟通过在猪卵母细胞成熟培养液中添加褪黑素，检测卵母细胞体外成熟率、多精受精发生率及与多精受精相关的细胞器分布情况，以期探讨褪黑素对猪卵母细胞多精受精的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究所有实验试剂均购置于Sigma（美国）公司，特殊说明的除外。

1.2 实验方法

1.2.1 猪卵母细胞的收集与体外培养 从华欣众贸肉业有限公司屠宰场获得猪卵巢，置于25～30℃含青霉素和链霉素的生理盐水中，2 h 内运回实验室。用18 号针头抽取直径为3～6 mm 卵泡内的卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte Complexs，COCs）。经洗卵液洗涤3次，在体式显微镜下挑取卵母细胞胞质均匀且周围包裹多层致密卵丘细胞的COCs，移入覆盖矿物油的500 µL卵母细胞体外成熟（In vitro Maturation，IVM）培养液中培养21 h，再转移至无激素（PMSG 和hCG）的IVM 培养液中继续培养21 h，培养条件为38.5℃、5%CO饱和湿度环境。

IVM 培养液采用TCM-199（Invitrogen）作为基础培养液，添加0.6 mmol/L 半胱氨酸，0.91 mmol/L丙酮酸钠，10 ng/mL EGF，10% 猪卵泡液，10 IU/mL PMSG，10 IU/mL hCG，1%青链霉素（Invitrogen）。在IVM 培养液中，褪黑素组、褪黑素+Luzindole 组分别添加1 nmol/L 褪黑素、1 nmol/L 褪黑素+1 nmol/L Luzindole（选择性褪黑素受体拮抗剂），不添加褪黑素及Luzindole 组作为对照组，进行后续实验。

1.2.2 卵母细胞体外受精及胚胎培养 COCs 经42 h 体外成熟后，使用0.05%透明质酸酶去除卵母细胞周围包裹的卵丘细胞，将成熟卵母细胞每15 枚置于25 µL 受精滴中。取1 mL 精液（精液由哈尔滨市双城区富泉种猪厂提供）置于37℃恒温培养箱中孵育15 min，2 000 r/min离心4 min；弃上清，加入1 mL DPBS，2000 r/min 离心4 min；弃上清，加入1 mL mTBM，重悬；按照500:1的精卵比稀释精液。在受精进行之前，要确保精子活力>80%。取25 µL 精液加入受精滴中，置于38.5℃、5%CO饱和湿度环境下孵育6 h 后，转移至PZM3 胚胎培养液中继续培养。培养48 h 观察卵裂率，168 h 观察囊胚率。

1.2.3 体外多精受精发生率的检测 受精卵于PZM3 胚胎培养液培养10 h 后，移入0.2% PVA-PBS 中洗涤3 次，每次1～2 min；将受精卵移入0.1%浓盐酸中，停留2～3 s，去除透明带；置于0.2% PVA-PBS 中洗涤3 次，每次1～2 min；使用10 µg/mL Hoechst 33342 将无透明带的受精卵室温下染色5 min，0.2% PVA-PBS 中洗涤3 次，每次1～2 min；凡士林封片，于荧光显微镜（Nikon，80i）下观察猪卵母细胞原核形成情况，统计多精受精发生率：双原核为正常受精；3个以上原核为多精受精。

1.2.4 皮质颗粒染色 将成熟卵母细胞置于4% 多聚甲醛中固定30 min；用含0.3% BSA+1 mol/L 甘氨酸的PBS（封闭液）清洗3 次，每次5 min；卵母细胞移入含0.1% Triton-X100 的PBS 中通透5 min，使用封闭液清洗3 次，每次5 min；卵母细胞放置到100 µg/mL 的FITC-PNA（Sigma，L7381）中室温避光染色30 min；凡士林封片，使用激光共聚焦显微镜（Leica，TCS SP8）观察皮质颗粒分布情况。皮质颗粒正常分布率计算方法：各组正常分布的卵母细胞个数/各组卵母细胞总数。

1.2.5 高尔基体染色 将成熟卵母细胞置于4%多聚甲醛中固定10 min，使用预冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次，每次1～2 min；卵母细胞移入5 mmol/L NBD C6-Ceramide（GeneCopoeia,C049）中，4℃ 避光染色30 min，使用预冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次，每次1～2 min；移入2%BSA-PBS 中室温孵育60 min，使用预冷的0.2% PVAPBS 清洗3 次，每次1～2 min；凡士林封片，使用荧光显微镜观察高尔基体分布情况。高尔基体正常分布率计算方法：各组正常分布的卵母细胞个数/各组卵母细胞总数。

1.3 统计分析 每组实验至少重复3 次。实验数据使用SPSS 17.0 通过单因素方差分析（ANOVA）和Duncan's检验进行分析，结果使用平均值± 标准误差表示。<0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 褪黑素对猪卵母细胞体外成熟的影响 由表1 可知，3 组之间卵母细胞成熟率无显著性差异，即褪黑素处理未对猪卵母细胞核成熟率产生显著影响。

表1 褪黑素对猪卵母细胞体外成熟率的影响

2.2 褪黑素对猪体外受精胚胎发育能力的影响 表2 显示，各处理组卵裂率无显著差异，但在培养168 h 后，褪黑素组的囊胚率显著高于对照组和褪黑素+Luzindole组，后2 组间差异不显著。

表2 褪黑素对猪体外受精胚胎发育能力的影响

2.3 褪黑素对猪卵母细胞多精受精发生率的影响 在胚胎培养10 h 后，检测猪卵母细胞多精受精发生情况，如表3 所示，褪黑素组的多精受精率低于对照组及褪黑素+Luzindole 组（<0.05），双原核胚胎形成率高于其他2 组（<0.05）。

表3 褪黑素对猪卵母细胞多精受精发生率的影响

2.4 褪黑素对成熟猪卵母细胞皮质颗粒分布情况的影响由图1 可知，褪黑素组皮质颗粒正常分布率高于对照组和褪黑素+Luzindole 组（<0.05）。

图1 褪黑素对成熟猪卵母细胞皮质颗粒分布情况的影响

2.5 褪黑素对成熟猪卵母细胞高尔基体分布情况的影响由图2 可知，褪黑素组高尔基体正常分布率高于对照组和褪黑素+Luzindole 组 （<0.05）。

图2 褪黑素对成熟猪卵母细胞高尔基体分布情况的影响

3 讨 论

本研究于猪卵母细胞体外成熟培养液中添加褪黑素或褪黑素+Luzindole，检测褪黑素对猪卵母细胞体外成熟及多精受精中的影响，结果显示，各组间卵母细胞核成熟率无显著差异，而褪黑素组多精受精率显著下降，体外受精后囊胚形成率显著提高，同时，卵母细胞皮质颗粒、高尔基体正常分布率显著增加。

3.1 褪黑素对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响褪黑素作为重要的抗氧化剂，在卵母细胞体外成熟过程中发挥着极为重要的作用。有研究表明，在小鼠、牛卵母细胞体外成熟过程中添加褪黑素可以明显改善卵母细胞的胞质成熟能力，如改善线粒体功能，提高GSH、ATP 水平及抗氧化基因的表达，改善DNA 损伤，调节卵母细胞脂质代谢，改善卵母细胞成熟质量等。本研究中，卵母细胞核成熟数据显示，各组间核成熟率并无显著性差异。在此前的研究中，He和Yaacobi-Artzi 等分别在小鼠和牛中也发现了同样的结果。而后，将成熟卵母细胞进行体外受精，发现褪黑素可显著提高囊胚形成率，而在褪黑素及其拮抗剂Luzindole 共培养时，该现象被明显抑制。据此推测，在猪卵母细胞体外成熟过程中，添加外源褪黑素尽管未能提高核成熟率，但很有可能提高卵母细胞的胞质成熟能力，进而改善体外受精胚胎的发育能力。

3.2 褪黑素对猪卵母细胞多精受精的影响 据报道，卵母细胞的体外受精及胚胎发育能力与卵母细胞的成熟质量密切相关，但在体外成熟过程中，卵母细胞常常受到氧化应激影响，导致核质成熟不同步，即当卵母细胞内的胞质成熟相关因子如细胞器分布等积累到成熟标准之前，细胞核会率先成熟，致使卵母细胞成熟质量较差。当质量较差的卵母细胞进行体外受精时，阻止多精受精的屏障尚未建立完全，即皮质反应或透明带反应不充分。本研究发现褪黑素可显著提高猪卵母细胞体外受精后的双原核胚胎率，同时显著降低多精受精的发生率。本研究结果证实褪黑素可显著降低猪卵母细胞多精受精的发生。

3.3 褪黑素对猪卵母细胞皮质颗粒及高尔基体分布的影响 皮质颗粒是受精前存在于卵母细胞质膜下的皮质层中的分泌小泡。在卵母细胞成熟过程中，皮质颗粒数量不断增加并逐渐向质膜迁移，呈线状排列，这是卵母细胞质成熟的标志之一。卵母细胞受精时，当第1个精子与卵母细胞融合，皮质颗粒会发生胞吐作用，以防止其余精子与卵母细胞融合。卵母细胞体外受精过程中的多精受精率较高，一部分原因是由于皮质颗粒未迁移至质膜区域或皮质颗粒数量较少，致使皮质反应不充分，从而导致卵母细胞不能有效阻止多精入卵。本研究通过检测皮质颗粒在成熟卵母细胞中的分布情况，发现在卵母细胞体外成熟培养液中添加褪黑素可以显著提高皮质颗粒正常分布率。皮质颗粒在卵母细胞的高尔基体中产生，同时，高尔基体作为蛋白质合成及运输的细胞器，在卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用。Cui 等研究表明，在卵母细胞成熟过程中添加高尔基体特异性抑制剂会导致减数分裂进程的损害，同时卵母细胞的胞质成熟指标如线粒体分布及皮质颗粒分布出现异常。本研究通过检测卵母细胞中高尔基体分布情况，发现在猪卵母细胞成熟过程中添加褪黑素可以显著提高高尔基体的正常分布率。由此表明，褪黑素可以明显提高与多精受精相关的细胞器，即皮质颗粒和高尔基体在成熟猪卵母细胞中的正常分布情况。

4 结 论

本实验结果显示，在猪卵母细胞体外成熟过程中添加1nmol/L 的褪黑素虽然没有提高猪卵母细胞的核成熟率，但可明显提高猪卵母细胞体外受精后囊胚形成率，同时提高了猪卵母细胞成熟时期的皮质颗粒、高尔基体的正常分布率，进而抑制了猪卵母细胞的多精受精发生