李丽萍，戴雁峰，2

（1.内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021；2.内蒙古福瑞锦牧业有限公司，呼和浩特 010105）

近年来，卵母细胞冷冻技术为众多有生育欲望的女性提供新途径的同时，也有效促进了畜牧业的高速发展。相比于先前的慢速冷冻法，现如今广泛应用的玻璃化冷冻法使细胞的冷冻技术更加成熟。但在玻璃化冷冻的过程中，由于超低温及高浓度的冷冻剂所带来的物理、化学损伤对卵母细胞内的细胞器及各部分结构造成不可逆的损害，进一步导致细胞的发育潜能及表观遗传损伤。本文探讨了玻璃化冷冻对牛卵母细胞的损伤以及目前常用的改善方法，以期降低牛卵母细胞玻璃化冷冻带来的损伤。

1 卵母细胞玻璃化冷冻研究发展概况

卵母细胞的冷冻保存为体外受精、核移植等技术的发展提供方便，还为濒危物种提供了一种全新的繁殖途径。同时，人卵母细胞冷冻技术的开展、实施也解决了冻存胚胎带来的伦理问题。

1977年，Whittinham［1］首次将小鼠卵母细胞取出后进行体外冻存，获得了健康的子代。玻璃化冷冻法主要是利用冷冻液经过迅速冷却，使细胞直接形成为不规则的形态，此方法能够维持细胞正常的离子、分子等的分布。

玻璃化冷冻技术在人类生殖保护及畜牧繁殖领域较为成熟。但是，各项研究表明，不同卵母细胞冷冻后的发育潜能区别较大。由于卵母细胞为单细胞、表面积与体积之比大、细胞内结构复杂等特点，其在冷冻复苏过程中困难重重。

关于人类和其他哺乳动物卵母细胞冻存的研究表明，冷冻造成的极端环境会对参与调控的DNA结构、细胞周期、线粒体稳态、产生能量的基因及蛋白的表达以及透明带、肌动蛋白丝、纺锤体、线粒体等细胞结构和维持钙稳态、皮质颗粒的诱导和释放等细胞功能均产生负面影响。

2 目前常用的玻璃化冷冻方法

2.1 开放式拉长管（Open pulled straw，OPS）

OPS是一种目前应用广泛的冷冻方法，这种方法解冻后的卵细胞具有更高的受精率。通过虹吸作用可以将加入冷冻液的卵母细胞吸入加热拉制而成的OPS管内，然后直接置于超低温的液氮内。解冻方法为直接将OPS管浸泡在38℃解冻液内，可以快速解冻释放卵细胞。这种方法冷冻和解冻速度极快，能够有效降低卵母细胞的损伤，使用OPS法冻存牛卵母细胞，相比于新鲜胚胎存活率虽略有下降，但胚胎率仍高达25%［2］。

2.2 玻璃微管（Glass micropipette，GMP）

该方法是由毛细玻璃管加热拉制而成的，又称为毛细玻璃管法。Kong等［3］最早是在胚胎上应用GMP法得到了较理想的结果。与OPS相比，GMP热传递效果更好，且可以避免解冻时管漂浮的问题，但缺点是易造成细胞的丢失［4］。许卫华等［5］研究表明，GMP在一定程度上减少了冷冻所带来的细胞损伤。

2.3 冷冻环法（Cryoloop）

Cryoloop以尼龙环作为载体，冷冻时将细胞转移至薄膜上，后置于液氮中冷冻保存。Lane等［6］试验表明，使用该方法的囊胚率高达54.2%。Gasparri⁃ni等［7］利用该方式冻存水牛的卵母细胞，解冻后的细胞卵裂率高达45%，并获得了体外成熟的牛囊胚胎。相较于OPS法，它的降温速度更快，有利于减少冷冻所带来的卵母细胞损伤。

3 冷冻对卵母细胞的损伤

玻璃化冷冻在各类卵母细胞的冻存过程中应用普遍，但是在冷冻过程中，对卵母细胞产生的损伤是无法规避的。牛卵母细胞对于降温极为敏感，冷冻保护剂的化学毒性以及解冻过程中渗透压的变化等都对卵母细胞造成损伤。

3.1 对卵母细胞结构上的损伤

卵母细胞是单细胞，细胞的表面积与体积之比大，冷冻剂易渗入卵细胞内对其造成物理性的损伤。在冻存过程中，细胞内外渗透压的变化会破坏细胞膜结构。另外，具有毒害作用的冷冻液在穿过细胞膜的过程中也会破坏细胞膜的结构。

透明带是保证卵母细胞正常受精的重要结构。冷冻过程中，细胞的皱缩和变形会导致颗粒细胞的提前释放，发生透明带反应。另外，冷冻会使透明带变硬，这些都会导致细胞卵裂率、囊胚率等下降以及多精入卵率的上升［8］。

3.2 对卵母细胞氧化应激上的损伤

冷冻后的卵母细胞的细胞器都会受到损伤，首先是线粒体的密度降低，嵴出现泡状，但在复苏后泡状化会消失。因此，线粒体的损伤会影响卵母细胞的生长发育但不致死。其次，细胞核中的核纤层会被损坏，这就使基因表达受到影响。

Cheiler等［9］在复苏的卵母细胞的细胞质内发现了低密度的小泡，这表明在冻存过程中细胞质结构发生了损伤。另外，细胞内的某些细胞器如线粒体、细胞骨架等也会受到损伤。

微管可形成纺锤体，其在细胞分裂时牵引染色体移向细胞两极。超低温会导致微管发生解聚，导致纺锤体形态不稳定［10］。有研究表明，冷冻后会出现纺锤体退化、畸形等现象，且解冻后不能恢复，这导致染色体无法准确的移向细胞两极［11］。

3.3 对卵母细胞发育上的损伤

相对于技术成熟的胚胎冷冻而言，卵母细胞冻存技术还需要进一步的探讨。卵母细胞为单细胞，表面积与体积之比大，且细胞内的结构复杂，对低温更敏感等种种因素致使卵母细胞的冻存难度加大。卵母细胞在冷冻解冻的过程中，经历的高浓度冷冻液的毒害作用以及超低温都会影响细胞的发育潜能。

3.4 对卵母细胞表观遗传上的损伤

作为表观遗传的重要表达方式，DNA甲基化可以通过DNA甲基转移酶在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶5'碳位连接一个甲基基团，在卵母细胞的冻存过程中DNA甲基化表达模式会发生系列的变化，进而调控复苏后的卵母细胞发育、胚胎发育及子代表型。

研究发现，冷冻后的小鼠卵母细胞中全基因组DNA甲基化水平明显降低，导致卵母细胞的发育能力降低［12］。张培培等［13］分别对新鲜和玻璃化冷冻的牛卵母细胞的全基因组甲基化水平分析，结果表明冷冻并不会对GV期牛卵母细胞的甲基化水平产生影响，但是对解冻后的GV期细胞体外成熟至MⅡ期后进行全基因组的甲基化水平分析时发现冷冻后牛卵母细胞甲基化水平显著降低，从而影响了牛卵母细胞的发育能力。

4 冷冻保存技术的改善

4.1 卵母细胞注射调控手段

叶酸受体4（Juno蛋白）。Bianchi等［14］发现Juno是受精过程中的关键蛋白。郝彤［15］通过反转录技术及显微注射技术，将Juno mRNA注射到卵母细胞中，进一步探讨了在玻璃化冷冻过程中，Juno蛋白对牛卵母细胞的影响机制。试验结果表明，向牛卵母细胞中注射200 pg Juno mRNA时可显著增强卵母细胞受精率、卵裂率和囊胚率等，这为玻璃化冷冻牛卵母细胞提供了新的技术手段。

4.2 冻存液成分添加抗冻保护剂

在玻璃化冻存过程中，卵母细胞可能会受到不可逆的损伤，无法修复，因此在牛卵母细胞冻存液中添加抗冻保护剂以防止冻存过程中细胞损伤是改善牛卵母细胞冻存体系的重要理论来源。

4.2.1 细胞松弛素B（Cytochalasin B，CB）CB作为一种微丝稳定剂，可以增加细胞骨架的弹性，缓解冻存导致的细胞损伤［16］。郭娟等［17］发现添加20µg/mL CB可以有效地改善牛卵母细胞的冷冻效果。Zhou等［18］发现冷冻前添加CB可以通过介导牛卵母细胞微丝的稳定性促进牛卵母细胞冻存效果，与王彩玲［19］、卞桂华等［20］研究结果一致。但郭娟［17］、Sripunya等［21］、Liang等［22］及Yamada等［23］的研究指出CB对牛卵母细胞的冻存保护效果并不适应于未成熟的牛卵母细胞，其具体机制及差异有待深入研究。

4.2.2 紫杉醇（Taxol）紫杉醇能够阻止微管的解聚，使得细胞内微管二聚体的结合更加紧密，在冷冻的过程中能够避免超低温所带来的微管损伤［18］。Park等［24］在对小鼠卵母细胞冷冻的研究中首次发现了紫杉醇对小鼠卵母细胞的保护作用；张家新等［25］发现紫杉醇处理虽然不能使绵羊卵母细胞存活率有所提升，但是0.5µmol/L紫杉醇处理后的绵羊卵母细胞囊胚率得到了有效改善。

Shayegh等［26］发现紫杉醇处理对牛卵丘复合体的冻存没有显著的促进作用，但Morató等［27］在玻璃化冷冻前用紫杉醇处理牛卵母细胞，结果表明在冷冻液中加入1µmol/L紫杉醇显著增强了牛卵母细胞的发育潜能。与此同时，Morató等［28］同样发现冷冻过程中添加紫杉醇可以有效地维持牛卵母细胞的纺锤体的形态，与Pitchayapipatkul等［29］研究结果一致。

4.2.3 抗冷冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）AFP最初是在深海鱼中提取的一种蛋白类物质，能够有效地抑制冷冻过程中细胞内冰晶的产生，复苏回温过程中，该蛋白类物质又进入失活状态［30］。目前已鉴定出的AFP有5种，分别为抗冻糖蛋白（Antifreeze glycoprotein）、AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ。Knight等［31］首次发现在细胞的冻存过程中添加AFP可以有效地保护细胞结构，从而减少冷冻过程对细胞结构造成的损害，而且添加AFP的保护效果已经在斑马鱼、山羊、猩猩、老鼠、兔子、水牛等生殖细胞、胚胎的冷冻过程中得到证实［32］。

Liang等［33］发现冷冻过程中添加抗冻糖蛋白可以有效地抑制因冷冻过程导致的活性氧积累、DNA断裂、细胞自噬、肌动蛋白损伤等现象，而且抗冻糖蛋白的添加可以有效地维持牛卵母细胞内的纺锤体组装、染色体排列及线粒体活性水平，从而显著提高牛卵母细胞的存活率，而且体外受精后牛卵母细胞的发育潜能得到有效地改善。

王勇杰等［34］分别在牛卵母细胞冷冻保护液中添加了不同浓度的AFPⅢ。试验结果表明，对于GV期卵母细胞，添加500 ng/mL AFPⅢ，可以有效地促进牛卵母细胞复苏后的发育潜能。而在MⅡ牛卵母细胞的玻璃化冷冻过程中，添加750 ng/mL AFPⅢ可以有效地促进牛卵母细胞复苏后的发育潜能，这表明添加AFPⅢ可以有效地降低细胞冷冻过程中卵母细胞的损伤。

4.2.4 钌红（Ruthenium red，RR）玻璃化冷冻后，卵母细胞内的线粒体受到损害，导致细胞内Ca2+水平升高，RR能够调控Ca2+水平从而改善卵母细胞解冻后的损伤。王娜等［35］通过往牛卵母细胞冷冻液中加入不同浓度的RR，检测线粒体内的Ca2+水平及解冻后的卵裂率、受精率、囊胚率、发育等情况，结果表明冷冻液中添加2µmol/L的RR能够显著改善冷冻对细胞的创伤，抑制细胞的凋亡，可以有效地促进牛卵母细胞冷冻效果。

5 结语

玻璃化冷冻技术虽然已经被广泛应用于牛卵母细胞的长期保存，但目前主要集中于对MⅡ和GV期细胞卵母细胞的研究。冷冻过程中不可避免的会发生细胞结构、氧化应激上的损伤。因此需要通过各种不同的调控方式来改善卵母细胞的冻存，主要包括对卵母细胞本身蛋白水平的调控以及冻存液成分的改善等手段来有效改善卵母细胞的冷冻保存方法。