张 静，仇 伟，黄 月，赵 欣，杨 兵,

（1.重庆化工职业学院环境与质量检测学院, 重庆 401228；2.山东省泰安英雄山中学, 山东泰安 271021；3.重庆第二师范学院，重庆市功能性食品协同创新中心, 重庆 400067）

肥胖是机体内脂肪大量堆积造成的一种身体不良状态[1]。肥胖可造成机体内的包括代谢系统和免疫系统等生理系统异常，增加患心血管疾病和癌症的风险[2-3]，还可能直接导致包括心脏病、糖尿病、脂肪肝等多种疾病[4-7]。肥胖还可能因为影响个体形象，造成肥胖者产生心理障碍[8]。肥胖人群多采用运动和控制饮食进行减肥，其中健康食品和科学的饮食都是有效减肥的手段。

柠檬是一种富含多种维生素、矿物质元素、柠檬酸和黄酮化合物的水果，其含有的有益物质具有包括抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗菌和预防心脑血管疾病等多种生物活性作用[9-14]。柠檬还具有良好的减肥效果，其中含有的柠檬酸能够控制餐后出现的血糖值上升；还能够促进机体产生乳酸，加快机体从食物获取的糖质和脂质的转化和消耗，防止能量在机体内的堆积[15]。另外，柠檬中含有的多种活性成分，能够加速血液循环和代谢速度，加快能量的代谢和消耗，也起到减脂的作用[16]。

有研究显示，有益微生物可以通过在肠道定殖起到改善肠道微生态的作用，从而减少食物进入肠道后的吸收时间，促使多余的脂肪和能量排出体外，减少机体吸收过量的能量物质，起到提升代谢率、控制体重的作用[17]。研究也显示果蔬发酵汁能够起到减肥作用[18]。但是现今国内的发酵饮品多采用进口发酵菌株，具有我国自主知识产权的优质发酵菌种还较为缺乏，本研究使用从新疆地区自然发酵酸乳中分离出的一株具有自主知识产权乳酸菌对柠檬汁进行发酵，并观察了发酵柠檬汁对高脂饲料致肥胖小鼠的减脂作用和肠道调节作用，初步探讨了发酵柠檬汁对肠道的调节能力及其产生减脂作用的机制，以期为进一步开发发酵柠檬汁积累理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬 四川安岳黄柠檬；植物乳杆菌KFY02新疆库尔勒维吾尔族牧民家庭自然发酵酸乳中分离鉴定出的植物乳杆菌，专利保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏号：CGMCC 15638）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；PCR引物（表1）、Oligo（dT）18、RNase、dNT和 MLV 酶 美国赛默飞公司；C57BL/6小鼠 重庆恩思维尔生物科技有限公司，本研究中动物实验经重庆功能性食品协同创新中心伦理委员会批准（批准号：202103041B）。

表1 小鼠肝脏及粪便实验使用的qPCR引物Table 1 qPCR primers used in mouse liver and feces experiment

Biomate3S分光光度仪、SepOne Plus定量PCR仪 美国赛默飞公司；正置光学显微镜 日本奥林巴斯公司；白洋BY-160C离心机 北京白洋医疗器械有限公司；Bioprep-24生物样品均质器 杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柠檬汁发酵 取新鲜的柠檬1 kg，去皮后榨汁，过4层纱布过滤得鲜柠檬汁。在过滤得到的柠檬汁中按10%和0.15%（w/v）加入葡萄糖和植物乳杆菌KFY02菌粉，置于36 ℃下发酵12 h，发酵完成后置于4oC冰箱中待用。

1.2.2 动物实验 50只6周龄雌雄各半的C57BL/6小鼠被置于恒温（2±2oC）恒湿（50%±5%）和每 12 h轮换照明的房间中饲养，同时小鼠被随机分为5组，分别为正常组、模型组、植物乳杆菌KFY02灌胃组、未发酵柠檬汁灌胃组和发酵柠檬汁灌胃组，每组10只小鼠。对除正常组外其余各组小鼠采用高脂饲料（表2）喂养，正常组小鼠采用正常饲料喂养，所有小鼠不限制饮水和饮食，持续喂养8周。在此过程中植物乳杆菌KFY02灌胃组小鼠每日按150 mg/kg（1.5×108CFU/kg） 灌胃量对小鼠实施灌胃植物乳杆菌KFY02，同时根据普通人群约每日60 mL纯柠檬汁摄入量来确定小鼠灌胃量，即未发酵柠檬汁组小鼠每日按10 mL/kg灌胃量对小鼠实施灌胃未发酵柠檬汁，发酵柠檬汁组小鼠每日按10 mL/kg灌胃量对小鼠实施灌胃发酵柠檬汁，同样持续8周，记录小鼠体重。8周后对小鼠禁食不禁水24 h，然后对小鼠实施断颈处死，心脏取血和取内脏及附睾脂肪组织进行相关测定并计算器官指数，器官指数=[器官质量（g）/小鼠体重（g）]×100[19]。

表2 实验中小鼠饲料配料Table 2 List of feed ingredients for mice in the experiment

1.2.3 小鼠血清和肝脏指标测定 将取出的全血样本在4oC下以4000 r/min的转速离心10 min得到上层血清。同时精确称量0.1 g肝组织，再在肝组织中加入0.9 mL生理盐水进行匀浆。将匀浆后组织在4000 r/min的转速离心10 min，收集上清液。采用ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和 HDL-C检测试剂盒测定血清和肝组织匀浆上清液小鼠血清和肝脏相关指标。

1.2.4 小鼠粪便中TC、TG和TP水平测定 小鼠禁食前收集各组小鼠的粪便，精确称量0.1g粪便，再在粪便中加入0.9 mL生理盐水进行匀浆。将匀浆后组织在4000 r/min的转速离心10 min，收集上清液。采用TC、TG和TP检测试剂盒测定粪便匀浆上清液相关指标。

1.2.5 小鼠肝脏和附睾脂肪组织病理学观察 解剖后收集小鼠的肝组织和附睾脂肪组织在10%的福尔马林中进行固定，在脱水48 h后，将组织样品分别进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（H&E）染色后通过光学显微镜观察组织的病理学变化[20]。

1.2.6 小鼠肝组织中mRNA表达的测定 精确称量1 g肝组织，在肝组织中加入9 mL生理盐水进行匀浆，再加入1 mL的RNAzol提取小鼠肝组织中的RNA。使用超微分光光度法在260和280 nm处测定提取到RNA的吸光度值，计算RNA纯度和浓度，将RNA浓度调整为1 μg/μL。然后通过反转录生成cDNA后，配制含1 μL cDNA的反应体系，其余试剂包括10 μL SYBR Green PCR Master Mix、7 μL无菌蒸馏水和上下游各1 μL引物溶液。在定量PCR仪中进行反应，反应条件为变性95 ℃持续60 s；95 ℃ 持续 15 s下进行 40个循环；退火 55 ℃持续 30 s；延伸 72 ℃ 持续 35 s；95 ℃ 持续 30 s；55 ℃持续 35 s。选择β-actin 作为内参，并按 2-ΔΔCt法对其相关基因进行分析[20]。

1.2.7 小鼠粪便中微生物mRNA表达的测定 精确称量1 g粪便，在粪便中加入9 mL生理盐水进行匀浆。再按1.2.6方法测定小鼠粪便中微生物mRNA表达，从而检测粪便中微生物的组成。

1.3 数据处理

所有实验进行三次平行测定，测定得到的结果以平均值表示，并计算出标准偏差，实验结果表示为平均值±标准偏差。同时采用单因素方差分析计算各组数据之间是否具有显著差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 实验过程中小鼠的体重变化

由图1可以看出，给予正常饲料的正常组小鼠体重在实验的8周中表现出平稳的体重增加，而给予高脂饲料的模型组小鼠体重大幅度增加，两组小鼠之间的体重差异在8周后达到了9.28 g。由于植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁组小鼠给予高脂饲料，实验过程中的体重均高于正常组，但是三组小鼠的体重也产生差异，发酵柠檬汁组小鼠高于正常组，低于植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和模型组。体重较正常状态大幅度增加是肥胖的重要表现，控制体重保持正常状态是保持健康的重要手段[21]。本研究中在给予相同高脂饲料的条件下，发酵柠檬汁中不仅含有柠檬汁中的功效成分，还含有大量有益菌，因此能够最大程度地减轻小鼠体重，效果明显优于植物乳杆菌KFY02和未发酵柠檬汁。

图1 实验过程中小鼠的体重情况Fig.1 Weight of mice during the experiment

2.2 小鼠器官指数

如表3所示，正常组小鼠的肝脏和附睾脂肪指数最低，而模型组小鼠的肝脏和附睾脂肪指数最高。相比模型组，植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁的肝脏和附睾脂肪指数均下降，其中发酵柠檬汁能够最大程度地降低肝脏和附睾脂肪指数，这些指数显著高于（P＜0.05）植物乳杆菌KFY02和未发酵柠檬汁组小鼠。机体体重增加后肝脏和体内的脂肪组织均会出现异常，有研究显示肥胖小鼠的肝脏和附睾脂肪组织指数高于正常状态[22]。本研究也得到了相同的结果，模型组由于诱导肥胖导致小鼠的肝脏和附睾脂肪组织指数高于正常组，发酵柠檬汁中含有的有效化合物和乳酸菌能够缓解肥胖造成的组织器官指数异常，这 表明发酵柠檬汁是一种具有良好效果的功能性饮料。

表3 小鼠的肝脏指数和附睾脂肪指数Table 3 Liver index and epididymal fat index in mice

2.3 小鼠血清和肝脏的ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平

肝脏是脂肪代谢的重要器官，肥胖状态下肝功能指标酶ALT、AST和AKP均会一定程度出现异常，所以ALT、AST和AKP均可作为肝功能的诊断酶[19]。同时，肥胖也对血脂产生异常，造成TC、TG、LDL-C水平异常上升，而HDL-C水平下降[23]。本研究中高脂饮食也造成肥胖小鼠（模型组）的ALT、AST、AKP、TG、TC、LDL-C水平异常上升，而HDLC水平异常下降（表4～表5）。正常组、发酵柠檬组、植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬组小鼠血清和肝组织的 ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C水平呈现出由低到高的趋势，都显著低于模型组（P＜0.05），而HDL-C水平呈现出由高到低的趋势，且显著高于模型组（P＜0.05）。

表4 小鼠血清ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Table 4 Serum ALT, AST, AKP, TC, TG, LDL-C and HDL-C levels in mice

表5 小鼠肝脏ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Table 5 Hepatic ALT, AST, AKP, TC, TG, LDL-C and HDL-C levels in mice

2.4 小鼠粪便的TC、TG和TP含量

由表6所示，正常组小鼠粪便中的TC、TG和TP含量显著高于（P＜0.05）其余各组，模型组小鼠粪便的TC、TG和TP含量最低。植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁均能够使肥胖小鼠粪便中的TC、TG和TP含量提高，且发酵柠檬汁提高粪便中TC、TG和TP含量的能力最强。TP、TC和TG大量聚集对机体的血脂和内脏，特别是肝脏都有较大影响[24]，研究显示益生菌可以促进代谢过程中TC、TG和TP通过排泄排出体外，从而有效减轻机体的负担，保护内脏，间接起到减脂的作用[18]。实验结果显示发酵柠檬汁能够较多的促进排便排出TC、TG和TP，起到良好的减脂作用。

表6 小鼠粪便TC、TG和TP含量（mmol/g）Table 6 Contents of TC, TG and TP in mouse feces(mmol/g)

2.5 小鼠肝组织和附睾脂肪组织的组织变化

H&E染色切片显示正常组小鼠肝组织细胞组织结构良好，肝小叶结构正常，细胞大小均匀，肝细胞边界清晰，细胞核居中（图2）。而模型组呈现出肝细胞变性，细胞边界消失，中央静脉形状不规则、肿胀等状态，且血管周围有大量脂肪空泡。植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁均能起到缓解这些病理变化的作用，且发酵柠檬汁的效果最优。

图2 小鼠肝组织的H&E染色病理学切片观察Fig.2 Observation on pathological sections of mouse liver tissue by H&E staining

同时，从图3可以看出正常组小鼠附睾脂肪组织的脂肪细胞较小且排列整齐，而模型组小鼠附睾脂肪组织的脂肪细胞较大且聚集。植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁均能降低脂肪组织的体积，且发酵柠檬汁降低组织体积的作用强于植物乳杆菌KFY02和未发酵柠檬汁，能够使脂肪组织形态接近于正常组。病理学观察是直观检测组织损伤的手段[25]，本研究中植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁均能够减轻肥胖造成的肝组织损伤和脂肪细胞堆积，发酵柠檬汁效果最好。

图3 小鼠附睾脂肪组织的H&E染色病理学切片观察Fig.3 Observation on pathological sections of mouse epididymal adipose tissue by H&E staining

2.6 小鼠肝组织 C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL和CYP7A1的mRNA表达

如图4所示，正常组小鼠肝组织PPAR-α、CPT-1、LPL和CYP7A1的mRNA表达显著强于（P＜0.05）其余各组，而C/EBPα和PPAR-γ的表达则显著弱于（P＜0.05）其余各组。模型组小鼠肝组织的表达趋势与正常组相反。相对模型组小鼠，植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁可以提升小鼠肝组织的 PPAR-α、CPT-1、LPL、CYP7A1的表达和降低 C/EBPα、PPAR-γ表达，发酵柠檬汁可以使C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和CYP7A1表达最为接近正常组小鼠。C/EBPα是生成脂肪和促进机体脂肪中高表达基因的关键转录因子，还能够提升TC在机体中的水平[26]。PPAR是脂肪细胞分化的核转录因子，在与能量稳态相关的组织中高度表达，能够感知和解释来自膳食脂质脂氧合酶或环氧合酶的脂肪酸信号。PPAR-α能够控制脂肪堆积和能量的积累，PPAR-γ选择性地上调对脂肪堆积和脂肪细胞大量产生的基因表达[27-28]。CPT1是一种参与TG分解代谢的关键酶，能够有效地分解TG，促进机体内的脂代谢保持正常[29]。LPL是一种TG代谢的调节蛋白，可将富含TG的脂蛋白进行分解，从而有效的控制高脂肪的摄入[30]。而CYP7A1能够调节TC和LDL-C水平，大量饮食脂质摄入后被激活，从而发挥减脂的作用[31]。研究显示有益微生物可以有效调节 C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和CYP7A1在机体中的表达[32]，同时，发酵过程也有可能产生新的化合物和代谢产物从而加强对这些表达的调控[33]，有利于减脂。由此可以看出，通过调控C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和CYP7A1表达能够起到减脂作用，发酵柠檬汁中含有的乳酸菌及发酵产物能够较好地调节这些表达，发挥其减脂减肥的作用，且强于单独作用的柠檬汁或乳酸菌。

图4 小鼠肝组织 C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和 CYP7A1 的 mRNA 表达Fig.4 mRNA expression of C/EBPα, PPAR-α, PPAR-γ, CPT-1, LPL and CYP7A1 in mouse liver tissue

2.7 小鼠粪便中厚壁菌门、拟杆菌门、乳酸杆菌和双歧杆菌的mRNA表达

如图5所示，正常组小鼠肝组织粪便中的厚壁菌门微生物的mRNA表达显著低于（P＜0.05）其他各组，而拟杆菌门和双歧杆菌的mRNA表达显著高于（P＜0.05）其他各组。诱导肥胖后，模型组小鼠粪便中的厚壁菌门微生物的mRNA表达最高，而拟杆菌门、乳酸杆菌和双歧杆菌的表达最低。植物乳杆菌KFY02、未发酵柠檬汁和发酵柠檬汁菌能够使肥胖小鼠粪便中的厚壁菌门表达降低，使拟杆菌门和双歧杆菌的表达增强，且发酵柠檬汁能够使这些微生物的表达最为接近正常组。另外，正常组和植物乳杆菌KFY02组的乳酸杆菌表达无显著差异（P＞0.05），高于未发酵柠檬组，而发酵柠檬组的乳酸杆菌表达最强。研究显示肠道中的微生物群与腹部脂肪的堆积有直接关联，健康的肠道微生物组成能够减少脂肪的堆积，不仅能促进肠道健康，还能够调节体脂和体重[31]。临床研究也进一步证实肠道微生物群的组成比单纯的饮食更能准确地预测腹部脂肪，是预判身体肥胖的新观察点[34]。通过测定排便中的微生物表达，可以判断出肠道菌群的情况[35]，本研究也采用定量PCR检测小鼠粪便中相应微生物表达。厚壁菌门微生物与肥胖相关，肠道里的厚壁菌门微生物多于拟杆菌门微生物的情况下将使机体能够充分吸收食物中的热量从而引发肥胖[36]。乳酸杆菌和双歧杆菌均是具有良好活性的益生菌，均能够有效促进脂代谢，起到保持肠道健康、促进脂肪代谢、保持体重和减脂的作用[37-38]。本研究也证实发酵柠檬汁能够促进小鼠肠道中产生更多的拟杆菌门微生物、乳酸杆菌和双歧杆菌，而减少厚壁菌门微生物，从而通过调控肠道微生物起到促进脂肪代谢，发挥发酵柠檬汁的减脂作用。

图5 小鼠粪便中厚壁菌门、拟杆菌门、乳酸杆菌和双歧杆菌的mRNA表达Fig.5 mRNA expression of Firmicutes, Bacteroidetes,Lactobacillus sp. and Bifidobacterium sp.in mouse faeces

3 结论

本研究观察了一种新发现的植物乳杆菌进行柠檬汁的发酵，通过动物实验观察了这种发酵柠檬汁对小鼠的减脂作用。实验结果显示，植物乳杆菌KFY02发酵柠檬汁能够有效地调控肥胖小鼠的体质，器官指数、肝功能和血脂相关指标，还能够调控肥胖相关的基因表达，从而发挥发酵柠檬汁的减脂作用。同时，本研究进一步显示了植物乳杆菌KFY02发酵柠檬汁能够调节小鼠肠道，使肠道微生物组成更为健康，从而保持机体健康和发挥减肥作用。但是本研究一方面对柠檬汁在发酵过程中成分的变化还研究不足，同时对肠道菌群的变化也缺乏更为细致的研究，另外还缺乏人体试验的结果，因此在进一步的研究中，还需要加强以上三方面的研究。