顾华蓉，张琦梦，穆洪涛，赵孟斌，陈瑜珠，高向阳,

（1.华南农业大学食品学院, 广东省功能食品活性物重点实验室, 岭南现代农业科学与技术广东省实验室, 广东广州 510642；2.广东第二师范学院生物与食品工程学院, 广东广州 510303；3.汕头鱼露厂有限公司, 广东汕头 515021）

鱼露是东南亚沿海国家的一种传统调味品，以低价值的鱼虾为原料，经自然发酵制成，具有独特的鲜美风味[1]。鱼露中的鲜味肽来自于原料的酶解产物，是鱼露独特滋味形成的重要原因[2]。目前对鲜味肽的研究多集中于分离鉴定，其呈鲜机理与构效关系尚不明确。鲜味肽评价主要依赖感官评价与电子舌分析，然而感官评价主观性强、误差大，电子舌又不能完全还原人的感官系统[3]，因此建立新型的鲜味评价模型对鲜味肽的研究具有重要意义。STC-1细胞为小鼠小肠内分泌细胞，它可以表达多种鲜味受体与传导元件，包括CaSR、GPRC6a、T1R1/T1R3、mGluR1、mGluR4、Gα-gustducin、PLC-β2 和 TRPM5[4-5]，其味觉信号传导机制与舌上皮味觉细胞极其相似[6]，均涉及味觉感受细胞内钙储存库中Ca2+的释放。同时，研究显示L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸等多种L-氨基酸及寡肽可引起STC-1细胞内的钙离子信号[7-10]，说明STC-1细胞可作为评价鲜味肽的感知模型。此外，Yue等[11]研究发现黄连等苦味化合物使STC-1细胞内钙离子显著增加，还使苦味受体TAS2R38的mRNA表达量增加，并通过基因敲除证明苦味化合物激活了TAS2R38受体。毛赟燕[12]用不同浓度的甜味剂刺激STC-1细胞，发现胞内钙离子浓度随蔗糖浓度增加而升高，且蔗糖可诱导甜味受体mRNA表达。这些研究表明具有鲜味、苦味、甜味或浓厚感的物质能引起STC-1细胞内钙离子信号响应以及相应味觉受体mRNA表达量的增加。然而，利用STC-1细胞对味觉物质的剂量效应研究却鲜有报道。

实验室前期从传统发酵1.5年的潮汕鱼露中分离鉴定出了多种二肽与三肽，其中大多数含有脯氨酸。脯氨酸是甜味氨基酸[13]，且Shinoda等[14]研究发现含有脯氨酸残基的苦味肽所呈现的苦味较温和、易被接受甚至令人愉悦，说明已鉴定出的脯氨酸二肽可能对鱼露鲜美滋味的形成起到重要作用。因此，本研究以实验室从鱼露中鉴定得到的12个脯氨酸二肽[2]为研究对象，利用STC-1细胞味觉感知模型，通过钙离子成像技术探究脯氨酸二肽呈味强度与浓度的关系，并通过实时荧光定量PCR探究介导鱼露脯氨酸二肽呈鲜的主要受体。本研究利用STC-1小鼠小肠内分泌细胞客观反映了鲜味肽的剂量效应，提供了一种鲜味肽呈味特性的新型评价方法，并为鲜味肽呈味机理与构效关系的研究提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼露中鉴定得到并进行固相合成的12个脯氨酸二肽（Ser-Pro、Pro-Ser、Gly-Pro、Pro-Gly、Ala-Pro、Pro-Ala、Val-Pro、Pro-Val、Tyr-Pro、Pro-Tyr、Ile-Pro、Pro-Ile）、二肽 pGlu-Pro（纯度≥98%）、qRTPCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；谷氨酸钠、蔗糖、柠檬酸、氯化钠 食品级，广州利成实业有限公司；奎宁 色谱纯，广州丛源仪器有限公司；STC-1小鼠小肠内分泌细胞（338701） 北京北纳创联生物技术研究院；杜氏细胞培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）（不含钙镁、酚红）、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、PBS缓冲液生化试剂 Gibco公司；Fluo-8 AM 超级纯，上海懋康生物科技有限公司；Steady Pure Universal RNA Extraction Kit、Evo M-MLV Premix for qPCR、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit 湖南艾科瑞生物工程有限公司。

ZA120R4万分之一分析天平 上海赞维衡器有限公司；Nikon ECLIPSE Ti系列倒置显微镜 日本尼康；5415R高速冷冻离心机 德国 Eppendorf；SMA4000微量紫外分光光度计 Merinton公司；A100基因扩增仪 杭州朗基科学仪器有限公司；StepOne实时荧光定量PCR仪 美国ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 感官评价 感官评价小组由10名味觉正常的学生组成（5女5男，年龄在20～25岁），并依据GB/T 16291.1-2012[15]接受了感官培训以辨别五种基本味觉（酸、甜、苦、咸、鲜）。参考丛艳君等[16]分别以柠檬酸（0.8 mg/mL）、蔗糖（10 mg/mL）、奎宁（0.8 mg/mL）、氯化钠（3.5 mg/mL）和谷氨酸钠（3.5 mg/mL）作为酸、甜、苦、咸、鲜的评价标准。样品以超纯水溶解，肽的初始浓度为2 mg/mL，并在此浓度下进行感官描述评价。采用三角试验法[17]确定每个鱼露二肽的味觉阈值，将恰好可以区分样品与空白溶液时的稀释倍数记为味觉稀释因子（Taste dilution，TD），该浓度即为肽的味觉阈值。稀释因子采用各感官评价员评定结果的平均值，且每个评定员之间的误差应不超过2个稀释水平。感官评价在恒定温度（24±1 ℃）下进行。

1.2.2 STC-1细胞内钙离子荧光信号测定 以8×104个/孔的密度将STC-1细胞接种于24孔板，每孔加500 μL含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，37 ℃培养24 h至细胞占据孔板的70%左右时进行实验，用5 μmol/L Fluo-8 AM钙离子荧光探针在37 ℃孵育细胞30 min，分别用HBSS与DMEM基础培养液（不含酚红）对细胞进行漂洗与脱酯化。将细胞置于荧光倒置显微镜下，在第20 s加入不同浓度的谷氨酸钠或脯氨酸二肽溶液，于490 nm（激发波长）和514 nm（发射波长）波长处采集细胞内钙离子荧光信号，每5 s一次图像采集，持续180 s。样品均以HBSS溶解，其中谷氨酸钠（monosodium glutamate, MSG）终浓度为 0.5、1、2、4、8 mmol/L，二肽终浓度为 0.25、0.5、1、2、4 mmol/L，空白组加入等量HBSS。

1.2.3 STC-1细胞鲜味受体mRNA表达量测定 将生长汇集至60%左右的STC-1细胞在含有3 mmol/L二肽的培养液中孵育8 h，提取细胞总RNA并反转录，再采用SYBR Green嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR，以鼠源GAPDH基因作为内参基因，检测不同二肽刺激下细胞内T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a受体mRNA表达量的变化。qPCR反应体系为20 μL：4 μL SYBR Green Premix Pro Taq HS Premix，2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，其余用去离子水补齐。反应程序为：第一步：95 ℃，30 s；第二步：95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40个循环。引物序列如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 数据处理

钙离子信号的响应强度表示为相对荧光变化[18]：

式中：F表示实际荧光值，即细胞区域“实时荧光值-背景荧光值”；F0代表0 s时的“F”。使用NISElements软件处理采集到的荧光图像，每次试验选择30个细胞区域进行统计。本实验每组平行测定4次。

qPCR实验每个肽样品设置3个实验平行，每个基因设置3个复孔，T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a的 mRNA 相对表达量表示为 2-ΔΔCt，ΔΔCt为实验组与对照组目的基因校正后PCR反应循环数的差值，其计算公式为：

实验结果以平均值±标准偏差（mean±SD）表示，利用SPSS 25.0软件对结果进行单因素方差分析，选择LSD法进行多重比较，数据后标注的不同字母表示数据间具有显著性差异（P＜0.05）。采用GraphPad Prism 8.0.1进行图像绘制。

2 结果与分析

2.1 脯氨酸二肽的感官评价

对13个合成脯氨酸二肽进行感官评价，其感官特性与稀释因子如表2所示。感官描述结果显示，所有二肽在2 mg/mL浓度下多具有酸味和鲜味，均未表现出苦味。二肽的酸味主要由于R基或C端残基中羧基的存在，其解离出的氢离子是引起酸味的重要物质[19]。目前已报道的鲜味肽中，有很多肽不仅具有鲜味，同时还可能呈现一定的酸味、甜味、浓厚感或收敛感，这说明鲜味肽的呈味效果不是单一的，而可能具有丰富的口感[20]。因此，本研究中的鱼露二肽可能对鱼露的呈鲜起到了重要作用。此外，稀释因子越大，说明肽的阈值越低，则呈味阈值较低的二肽有Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Tyr-Pro、Pro-Ile和 pGlu-Pro。

表2 脯氨酸二肽的感官评价结果Table 2 Sensory evaluation of proline dipeptides

2.2 STC-1细胞对脯氨酸二肽钙离子荧光响应

首先对鲜味基准物谷氨酸钠引起的STC-1细胞响应进行测定。分别用0.5、1、2、4、8 mmol/L的谷氨酸钠溶液刺激STC-1细胞，得到细胞内钙离子荧光强度随时间变化的曲线（图1）。相对荧光变化率大于0代表胞内钙离子浓度增加，说明样品引起了细胞响应。由图1可看出，相对荧光强度在加入谷氨酸钠后迅速增加，持续一段时间后荧光开始减弱并逐渐恢复至平常状态。图1中显示谷氨酸钠在0.5 mmol/L时未引起明显相对荧光变化，而在浓度达到1 mmol/L时引起明显钙荧光信号，说明其阈值介于0.5～1 mmol/L之间。人对谷氨酸钠的感官阈值为0.012 g/100 mL[21]，即0.7 mmol/L，与本实验结果相符合。为了尽可能排除加入样品时物理压力所引起的胞内钙离子浓度变化带来的误差，将相对荧光变化值大于或等于0.1（ΔF/F0≥0.1）视为有效钙信号，同时将能够引起ΔF/F0≥0.1的最低浓度记作细胞对刺激物的响应阈值，因此，将1 mmol/L记录为STC-1细胞对谷氨酸钠的响应阈值。

图1 不同浓度谷氨酸钠引起的STC-1细胞钙离子荧光响应Fig.1 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of MSG

根据谷氨酸钠浓度，将13个脯氨酸二肽分别以0.25、0.5、1、2、4 mmol/L浓度刺激 STC-1细胞，得到不同程度的钙信号响应曲线。pGlu-Pro是一种已在酱油、麦麸等物质中被分离鉴定出来的鲜味肽[22]，图2表明pGlu-Pro引起了STC-1细胞内的钙离子信号，进一步证明STC-1细胞可对鲜味物质产生响应。鱼露脯氨酸二肽引起的钙离子响应情况如图3所示，结合感官评价结果，所有脯氨酸二肽均未呈现苦味，说明钙信号并不由苦味引起，而可能主要由二肽激活其他G蛋白偶联受体（如鲜味或甜味受体）所引起。与谷氨酸钠响应曲线类似，在加入样品后，胞内钙离子浓度在短时间内迅速增加至最大值再逐渐回归常态。但是有些肽的曲线在一段时间内保持稳定状态并缓慢回落，而有些会在达到顶峰后迅速降低，这可能与肽的呈味特性有关。其中，Gly-Pro、Ala-Pro、Ser-Pro与pGlu-Pro的荧光曲线变化相对平滑，在达到峰值后回落缓慢，说明细胞内的钙离子能在一定时间内保持较高浓度，这可能会引起下游信号的持续传递，从而可能使得这些肽的呈味持续性较强且口感醇厚。相反有些肽的荧光信号由峰值回落的过程迅速，曲线较为尖锐，这可能表明肽的后味或持续感不足。

图2 不同浓度pGlu-Pro引起的STC-1细胞钙离子荧光响应Fig.2 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of pGlu-Pro

图3 不同浓度脯氨酸二肽引起的STC-1细胞钙离子荧光响应Fig.3 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of proline peptides

将13个脯氨酸二肽与谷氨酸钠的钙离子荧光信号响应在相同氨基酸浓度下进行比较，各浓度下的荧光响应强度如折线图4所示。除Pro-Ser与Val-Pro未引起有效钙信号（ΔF/F0≥0.1），其余11个二肽均引起不同程度的钙信号增强，其中Ser-Pro、Gly-Pro、Pro-Gly、pGlu-Pro、Ile-Pro与 Pro-Ile的荧光响应随氨基酸浓度增加而增强；Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Tyr-Pro与Pro-Tyr的响应强度在一定范围内随浓度增加而增加，而达到一定浓度后，其响应强度反而减弱。这说明肽的呈味效果可能并不会随着浓度的增加而一直增强，而可能浓度越大，呈味效果越差。Zhuang等[23]通过感官评价实验发现多肽ALPEEV、LPEEV、EAGIQ在浓度小于2 g/L时对谷氨酸钠有增鲜作用，而在浓度超过2 g/L后，肽会呈现出非常强烈的酸涩味，反而会抵消增鲜作用。Xu等[24]自草菇鉴定出鲜味肽ASNMSDL与LQPLNAH，在谷氨酸钠的存在下，这两个多肽的鲜味强度在浓度为15 mg/mL之前随肽浓度的增加而增强，而在超过15 mg/mL之后鲜味下降。本实验从细胞响应的角度也得到了相似的结论。此外，Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala与pGlu-Pro在各浓度下的钙信号强度均高于谷氨酸钠，推测它们可能具有优于鲜味基准物的呈味强度，而Tyr-Pro几乎在各浓度下的钙信号均弱于谷氨酸钠。

图4 脯氨酸二肽的荧光响应强度随浓度变化情况Fig.4 Fluorescence response intensity of proline dipeptides varies with concentration

STC-1细胞对脯氨酸二肽的钙离子荧光响应情况如表3所示，11个引起钙信号的二肽中，除Pro-Gly的阈值为2 mmol/L，其余10个肽的响应阈值均小于或等于1 mmol/L，其中在相同氨基酸浓度下阈值低于谷氨酸钠的二肽有Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Pro-Ile、pGlu-Pro。结合感官评价结果，这些钙信号响应阈值较低的二肽也具有较大的稀释因子，说明二肽的呈味阈值与细胞响应阈值有一定相关性。兼具最低响应阈值（0.25 mmol/L）与较强最大信号响应（ΔF/F0≥0.5）的肽有 Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val与 Pro-Ile，表明这些二肽具有较强的呈鲜特性。在实验浓度范围内，除Tyr-Pro外的10个脯氨酸二肽的最大钙信号强度均高于谷氨酸钠，将其按数值大小排序为Ile-Pro≈Pro-Val＞Ser-Pro＞Ala-Pro＞Pro-Ala＞Pro-Tyr＞Pro-Ile＞Gly-Pro≈Pro-Gly≈pGlu-Pro（“≈”表示两者无显著性差异）。

表3 STC-1细胞对脯氨酸二肽的钙离子荧光响应情况Table 3 Calcium fluorescence response of STC-1 cells to proline dipeptides

2.3 脯氨酸二肽对STC-1细胞鲜味受体mRNA表达量的影响

文献报道采用甜味或苦味化合物、氨基酸及浓厚感肽刺激STC-1细胞，发现相应味觉受体的mRNA表达量增加，并通过基因敲除等方法验证了这些味觉物质的呈味依赖于相应受体，说明味觉物质能促进相应味觉受体mRNA的表达[10-12]。异源二聚体T1R1/T1R3已被确定是主要的鲜味受体[25-26]；CaSR与GPRC6a对某些L-氨基酸敏感，被看作是鲜味的候选受体[20,27-29]。因此本研究对鱼露脯氨酸二肽刺激下STC-1细胞中T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a基因的mRNA表达量进行测定，探究脯氨酸二肽对鲜味受体基因表达的影响，进而判断介导脯氨酸二肽呈鲜的受体。结果如图5所示，相对表达量大于1说明实验组的mRNA表达量大于空白组。在含有3 mmol/L二肽的完全培养液中培养8 h后，细胞中各个鲜味受体的mRNA表达量发生了不同程度的变化。已报道的鲜味肽pGlu-Pro对T1R1、T1R3和GPRC6a的mRNA表达量有上调作用，证明鲜味物质可促进鲜味受体mRNA的表达。

图5 脯氨酸二肽对STC-1细胞鲜味受体mRNA表达量的影响Fig.5 Effect of proline dipeptides on mRNA expression of umami receptors in STC-1 cells

13个脯氨酸二肽中有11个肽对T1R1的mRNA表达具有上调作用，其中Ser-Pro、Gly-Pro、Pro-Gly、Ala-Pro、Pro-Val、Tyr-Pro与 pGlu-Pro对T1R1上调作用显著（P＜0.05），多为X-Pro肽，说明这些脯氨酸二肽可能激活了T1R1受体从而呈现鲜味。有8个肽对T1R3的mRNA表达有上调作用，其中具有显著上调作用（P＜0.05）的均为Pro-X二肽（Pro-Gly、Pro-Val、Pro-Ile），而有轻微上调作用的均为XPro二肽（Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Val-Pro、pGlu-Pro）。日本学者认为CaSR是浓厚感物质的主要感受器，可感知浓厚感肽[30]，结果显示Pro-Tyr与Ile-Pro对T1R1、T1R3无显著影响，但对CaSR有显著上调作用，说明它们可能激活了CaSR而呈现浓厚感。对GPRC6a有显著上调作用的肽有Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Pro-Ile与 pGlu-Pro，其中在 Ala-Pro与Pro-Ala的影响下GPRC6a的mRNA表达量分别达到了空白组的29倍和16.5倍左右，这可能与GPRC6a对小分子中性L-氨基酸敏感有关[31]。与钙信号响应实验结果一致的是，Pro-Ser与Val-Pro对四个受体的表达并无显著上调甚至有抑制效果，进一步解释了这两个肽不具有鲜味的原因。

此外，氨基酸组成相同的一对肽，其钙信号响应活性及对鲜味受体表达的影响大多有明显区别，说明肽的一级结构影响其呈味活性。Ishibashi等[32]通过感官评价发现二肽Phe-Pro的苦味明显强于Pro-Phe，说明氨基酸的排列顺序确实会影响肽的呈味特性。Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Val对四个受体 mRNA的促表达程度均分别强于Pro-Ser、Pro-Ala和Val-Pro，且在胞内钙信号实验中，Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Val具有更低的阈值及更大的最大响应值，表明二肽的呈味活性与其对鲜味受体mRNA表达的影响之间可能存在一定正相关性。

3 结论

本文以STC-1细胞为味觉感知模型，结合感官评价，对鱼露中脯氨酸二肽的呈鲜特性进行了研究。结果表明，鱼露中的12个脯氨酸二肽多具有鲜味和酸味，均无苦味；二肽的呈味阈值与其细胞响应阈值有一定相关性，且呈味强度高的肽其响应阈值也较低。呈味活性较强的肽按强弱顺序依次为Pro-Val、Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Ile，其中Ser-Pro、Ala-Pro与Pro-Ala活性强于谷氨酸钠，它们可能是鱼露呈鲜的关键鲜味肽。脯氨酸二肽对四个鲜味受体的mRNA表达量有不同程度的影响，多数对T1R1的表达有上调作用，表明T1R1可能是介导脯氨酸二肽呈鲜的重要受体。此外，脯氨酸二肽的呈味活性与其对鲜味受体mRNA表达的影响之间存在一定正相关性。本研究提供了一种非人工感官的评价方法来反映鲜味肽的呈鲜特性，同时为鲜味肽呈味机理的研究提供了一定理论基础。鱼露脯氨酸二肽呈鲜的构效关系尚未明确，下一步将利用分子对接方法对这些二肽与鲜味受体的相互作用进行研究，同时这些鲜味肽与其他鲜味物质的协同效应也有待进一步探索。