刘维兵 杨 林 包晓玮

1.青岛德慧海洋生物科技有限公司 山东青岛 266000

2.新疆农业大学食品科学与药学学院 新疆乌鲁木齐 830000

肉类制品因含有丰富的营养物质，且存在杀菌不彻底的情况，极易发生腐败变质。与其它防腐保鲜技术相比，添加防腐剂对肉制品进行防腐保鲜，具有操作简便、成本低廉的优点，是肉制品加工中经常使用的方法。目前市面上防腐剂大多为化学防腐剂，过量使用极易产生毒副作用，因此需要一种无毒副作用，且能达到抑菌防腐作用的天然防腐剂。近年来，从天然植物中提取的有效活性物质被验证抑菌谱广，可以有效地抑制肉类产品中微生物的生长，应用于肉类产品中可以满足人类对绿色、健康、安全的产品需求[1，2]。

目前从天然植物提取物中提出的有效活性物质又被称作为“植物源”，从天然植物中提出的单体成分，如茶多酚等单独使用无法做到广谱抑菌，且抑菌防腐效果一般，添加量小无法达到抑菌效果，而添加量增大又会影响肉制品的感官品质[3～6]。

本试验采用粗犷提取方法，从多种天然植物中提取各种有效活性成分。以总黄酮为评价指标，通过不断优化提取工艺参数，最终得到一款天然植物抑菌剂，通过验证该天然植物抑菌剂具有抑制肉制品中微生物生长的作用，且能延缓肉制品中挥发性盐基氮含量的增长速率[7～9]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

决明子，青岛德慧海洋生物科技有限公司；

迷迭香、刺梨根、刺山柑，新疆农业大学；

沙棘种皮，青河县惠华商贸有限公司；

绿茶，崂山区山海游农渔特产经销处；

鸡胸肉，青岛市城阳蔬菜水产品批发市场；

平板计数培养基，上海保藏生物技术中心；

化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 设备、仪器

电子天平LE2002E/02，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

旋转蒸发器RE-3000E，上海耀特仪器设备有限公司；

立式高压灭菌器LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂；

生物安全柜HR40-IIA2，青岛海尔特种电器有限公司；

紫外-可见分光光度计TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

将天然决明子种子胚芽、迷迭香地上部分、刺山柑、刺梨根、沙棘种皮、绿茶等分别粉碎，过60目筛分离杂质，按质量比1∶1∶1∶1∶1∶1，混匀备用。

1.2.1 设计天然提取物单因素试验

1.2.1.1 提取温度对总黄酮含量的影响

依据以往研究，控制超声提取时间为3h，料液比为1∶30，乙醇浓度为65%，将超声提取温度分别设为20、35、50、75、90℃。提取结束后测定提取物的总黄酮含量确定最佳提取温度。

1.2.1.2 提取时间对总黄酮含量的影响

控制超声提取温度为50℃，料液比为1∶30，乙醇浓度为65%，将超声提取时间分别设为1、2、3、4、5h。提取结束后测定提取物的总黄酮含量确定最佳超声提取时间。

1.2.1.3 料液比对总黄酮含量的影响

控制超声提取时间为3h，超声温度为50℃，乙醇浓度为65%，将料液比分别设为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。提取结束后测定提取物的总黄酮含量确定最佳料液比。

1.2.1.4 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

控制超声提取时间为3h，超声温度为50℃，料液比为1∶20，将乙醇浓度分别设为35%、50%、65%、80%、95%，提取结束后测定提取物的总黄酮含量确定最佳料液比。

1.2.2 设计天然提取物正交试验

根据单因素试验结果，影响总黄酮含量的主要因素有提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度。故以此四因素设计L9(34)正交试验，以提取物中总黄酮含量为评价指标，确定提取的最佳工艺条件(见表1)。

表1 L9(34)正交试验的因素与水平

1.2.3 天然植物提取物总黄酮含量测定

天然植物提取物中黄酮含量的测定采用改良比色法。将萃取液或(+)儿茶素标准溶液的样品(0.25mL)与蒸馏水(1.25mL)在试管中混合，然后加入5%NaNO2溶液(75mL)。静置5min后，加入10%AIC13.6H2O溶液(150mL)，然后将混合物静置另外6min，加入1M NaOH(0.5mL)。用蒸馏水将混合物稀释至2.5mL，并充分混合。与类似制备的含有已知(β)-儿茶素浓度的标准品相比，立即用分光光度法在510nm处对空白进行了吸光度测量。

1.2.4 天然植物提取物抑菌防腐测定试验

取20mL天然植物提取液，按体积比1∶10加入无菌生理盐水进行稀释，取100g鸡胸肉，将鸡胸肉浸泡在天然植物提取稀释液中20min，文火煮熟取出鸡胸肉再次浸泡20min，对照组采用同体积的生理盐水浸泡处理，置36℃霉菌培养箱中贮藏。

1.2.4.1 天然植物提取物抑制鸡肉中菌落总数试验

每隔24h取肉样2g溶于200mL无菌生理盐水中，做梯度稀释，取稀释液200μL涂布于平板计数培养基上，48h后观察菌落总数。

1.2.4.2 鸡肉中挥发性盐基氮含量测定试验

称取2～5g试样(精确到0.0001g)于50mL具塞锥形瓶中，加蒸馏水30mL，旋涡振荡10min，4 000r/m离心10min，上清液为样液，取20mL的2%硼酸溶液于150mL锥形瓶中，加混合指示剂2滴，使凯氏蒸馏装置的冷凝管末端浸入此溶液,蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此溶液为橙红色，否则补加硫酸，准确移取10mL样液注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL的氧化镁溶液，小心提起玻璃塞使其流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水封好，防止漏气，蒸馏10min，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液，吸收氨后的吸收液立即用0.01mol L盐酸标准液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点，同时进行试剂空白测定。按照公式(1)进行计算。

(1)

式中：

X—样品中挥发性盐基氮的含量，mg/100g；

V1—滴定试样时所需盐酸标准溶液体积，mL；

V2—滴定空白时所需盐酸标准溶液体积，mL；

c—盐酸标准溶液浓度，mol/L；

m—试样重量，g；

V—试样分解液蒸馏用体积，mL；

V0—样液总体积，mL；

14—与1.00mL盐酸标准滴定溶液[c(HCI)=1.000mol/L]相当的氮的质量，mg。

1.3 数据处理

每次实验均进行3次重复操作，所有实验数据采用SPSS 16.0 统计软件对结果进行显著性分析，处理结果均以X±SD表示，图表制作利用Excel 2003软件。

2 结果与分析

2.1 提取温度对总黄酮含量的影响

如图1所示，随提取温度的升高，总黄酮含量也在不断上升。当提取温度升高到50℃时，随着提取温度的不断上升，总黄酮含量反而出现下降的趋势；提取温度在50℃时，总黄酮含量达到最高峰。故将提取温度初步定为50℃。

图1 提取温度对总黄酮含量影响

2.2 提取时间对总黄酮含量的影响

如图2所示，随提取时间的延长，总黄酮含量也在不断上升；当提取时间延长到3h时，随着提取时间的再次延长，总黄酮含量基本保持不变。故将提取时间初步定为3h。

图2 提取时间对总黄酮含量影响

2.3 料液比对总黄酮含量的影响

如图3所示，随着溶剂液体的不断增大，总黄酮提取含量在不断下降，当料液从1∶10减小到1∶20时，总黄酮含量基本保持不变；但将1∶20的料液比继续稀释，总黄酮含量出现下降趋势。故初步将料液比定位1∶20。

图3 料液比对总黄酮含量影响

2.4 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

如图4所示，随着乙醇浓度的不断增大，总黄酮提取含量也在不断上升，但当乙醇浓度达到65%时，出现拐点；随着乙醇浓度的继续增长，总黄酮含量反而出现下降的趋势。故初步将乙醇浓度定为65%。

图4 乙醇浓度对总黄酮含量影响

2.5 正交结果分析

通过分析试验极差值可以看出(见表2)，影响提取物总黄酮含量的因素主次顺序为A>B>D>C，提取温度为主要控制因素，其次是提取时间，最优组合是A2B3C1D2。综合来说，对因素A、B、C、D分析，确定优水平为A2、B3、C1、D2。以最佳工艺A2B3C1D2进行验证试验，得出提取液总黄酮含量为8.26g/100mL。故选择配方为A2B3C1D2为最佳配方，即提取温度为50℃，提取时间为4h，料液比为1∶20，乙醇浓度为65%。

表2 L9(34)正交实验设计与结果

3 总结

天然植物提取物的最佳工艺条件为，提取温度为50℃，提取时间为4h，料液比为1∶20，乙醇浓度为65%，得出提取液总黄酮含量达到最大值为8.26g/100mL。应用天然植物提取物的肉制品，TVB-N、菌落总数与对照组相比显著降低(p<0.01)。天然植物提取液具有明显抗菌活性。