张文岭 赵飞飞 赵 丹 杜国涛 张兆波 李兰梅

(1 河北省沧州市人民医院中药房，沧州市 061000，电子邮箱:zhangwenling656@163.com；2 河北省沧州市中西医结合医院工会，沧州市 061013)

伴随人们健康意识的提高，食用菌作为我国膳食食谱中重要的“药食同源”食材，因具有改善机体新陈代谢、促进血液循环、降低胆固醇/血压/血糖、增强免疫力及抗肿瘤效果[1]，受到越来越多的关注。竹荪系鬼笔科竹荪属大型食用菌，又名竹笙、竹参和面纱菌，为寄生在枯竹根部的一种隐花菌类，其中长裙竹荪、短裙竹荪、棘托竹荪和红托竹荪4个亚种常供食用。竹荪的营养价值较高，富含多糖、蛋白质、核酸、多肽、维生素、多酚和矿物质等，其多糖提取物可发挥显著的抗肿瘤作用[2]，因此其具有较好的应用开发前景。本研究选择乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞HeLa、胃癌细胞MGC803和结肠癌细胞LoVo作为研究对象，分析竹荪多糖对5种肿瘤细胞增殖的抑制作用，从而为竹荪多糖的药效学研究提供数据支持，也为食用菌的综合开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞HeLa、胃癌细胞MGC803和结肠癌细胞LoVo均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清(批号：19C111)购自美国Sigma-Aldrich公司；高糖杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；批号：16A14B97)购自武汉博士德生物科技有限公司；RPMI 1640培养基(批号：ABB210359)购自美国HyClone公司；青霉素、链霉素混合液(批号：20200702)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(批号：20200617)、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT；批号：M8180)和磷酸缓冲盐溶液(批号：A8020)均购自北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO；批号：RNBF3184)购自美国Amresco公司；氯仿、正丁醇均为分析纯。竹荪购自江中食疗科技有限公司。

1.2 器材 超净工作台购自美国Thermo公司，ELX800型酶标仪购自美国BioTek公司，CO2培养箱购自中国HealForce公司；自动细胞计数仪购自美国Invitrogen公司；96孔培养板购自无锡耐思生物科技有限公司，KDC-140HR型冷冻离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；BILON-1000CT型多用途恒温超声波提取机购自上海比朗公司。

1.3 竹荪多糖的提取 将干燥的竹荪除杂、粉碎、过筛(100目)，得到竹荪粉末，加8倍体积95%乙醇浸泡24 h，抽滤、风干、密封保存备用。取竹荪多糖粉末30 g，加入约33倍体积蒸馏水，于 70℃、500 W下超声波辅助提取30 min，95℃水浴振荡浸提1 h[3]。于4℃下4 000 r/min离心10 min取上清液，浓缩后加入 4 倍体积无水乙醇，4℃过夜。于4℃下4 500 r/min离心6 min取沉淀物，冷冻干燥后得竹荪粗多糖。将 Sevage 试剂(氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1)与糖液按1 ∶3体积混合，振摇30 min，静置分层，取上层多糖溶液，重复2次[4]。将多糖溶液浓缩至1 ∶1后装入透析袋(截留分子量8 000)中，蒸馏水透析 96 h，真空冷冻干燥后得到纯化后的多糖。采用硫酸-苯酚法测定竹荪多糖提取物的多糖含量达91.27%。

1.4 肿瘤细胞株的培养 取出冻存于液氮罐中的5种肿瘤细胞进行常规复苏，即在37℃水浴锅中迅速完全融化，于4℃下3 500 r/min离心5 min，弃去上清。分别将乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2和结肠癌细胞LoVo接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，宫颈癌细胞HeLa和胃癌细胞MGC803细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，各培养基中添加1%青霉素、链霉素混合液，置于培养箱中常规培养(37℃、5% CO2、饱和湿度)，每隔3 d换液，待细胞生长融合达80%～90%时，取对数生长期的细胞进行实验。

1.5 肿瘤细胞增殖的抑制实验 5种肿瘤细胞均分为不同浓度竹荪多糖组、阴性对照组及空白对照组进行实验，其中实验组接种肿瘤细胞并加入含不同浓度竹荪多糖的培养基，空白对照组只加入等量完全培养基但不接种肿瘤细胞，阴性对照组接种肿瘤细胞但只加入等量完全培养基。取对数生长期的5种肿瘤细胞，分别按1×104个/孔接种于96孔培养板(200 μL/孔)，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃去旧培养基，加入含不同浓度(10、20、40、60 μg/mL)竹荪多糖的培养基200 μL，空白对照组和阴性对照组加入不含竹荪多糖的完全培养基200 μL。将5种肿瘤细胞继续培养24 h、48 h和72 h后弃去上清液，在相应时间点每孔加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，继续培养4 h，取出各组肿瘤细胞，弃上清液后各孔加入DMSO 150 μL，摇床20 min;酶标仪设定波长为490 nm，记录各组肿瘤细胞相应吸光度值。根据吸光度值计算竹荪多糖对5种肿瘤细胞的增殖抑制率，以各肿瘤细胞空白对照组作为调零孔，实验组吸光度值=竹荪多糖组吸光度值-空白对照组吸光度值，对照组吸光度值=阴性对照组吸光度值-空白对照组吸光度值，增殖抑制率=(1-竹荪多糖组吸光度值/对照组吸光度值)×100% 。每组设3个复孔。

1.6 统计学分析 采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 竹荪多糖对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用 在各个时间点，不同浓度竹荪多糖组间乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制率差异均无统计学意义(均P>0.05)；除10 μg/mL竹荪多糖组中干预48 h后的乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制率低于干预24 h后的增殖抑制率(P<0.05)，其他浓度竹荪多糖组中均未观察到乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制率随时间变化的趋势(均P>0.05)。在各个时间点，不同浓度竹荪多糖组的乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制率均低于15%，未见随给药浓度增加及给药时间延长而产生抑制细胞增殖的作用。见表1。

表1 干预不同时间后各浓度竹荪多糖组乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 竹荪多糖对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用 在给药24 h、48 h、72 h时，20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL竹荪多糖组的肝癌细胞HepG2增殖抑制率均高于10 μg/mL竹荪多糖组(均P<0.05)；而在给药24 h、48 h时，40 μg/mL、60 μg/mL竹荪多糖组的肝癌细胞HepG2增殖抑制率均高于20 μg/mL竹荪多糖组，在给药72 h时，60 μg/mL竹荪多糖组的肝癌细胞HepG2增殖抑制率均高于20 μg/mL竹荪多糖组(均P<0.05)。

在10 μg/mL、20 μg/mL竹荪多糖组中，肝癌细胞HepG2增殖抑制率均随着给药时间的延长而增加(均P<0.05)；而在40 μg/mL竹荪多糖组，给药72 h时的肝癌细胞HepG2增殖抑制率高于给药24 h时，在60 μg/mL竹荪多糖组，给药72 h时的肝癌细胞HepG2增殖抑制率均高于给药24 h及48 h时(均P<0.05)。见表2。

表2 干预不同时间后各浓度竹荪多糖组肝癌细胞HepG2的增殖抑制率(x±s，%)

2.3 竹荪多糖对宫颈癌细胞HeLa增殖的抑制作用 在各个时间点，不同浓度竹荪多糖组间、组内宫颈癌细胞HeLa增殖抑制率差异均无统计学意义(均P>0.05)，抑制率均低于14%，未见随给药浓度增加及给药时间延长而产生抑制细胞增殖的作用。见表3。

表3 干预不同时间后各浓度竹荪多糖组宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制率(x±s，%)

2.4 竹荪多糖对胃癌细胞MGC803增殖的抑制作用 除60 μg/mL竹荪多糖组中干预24和48 h后的胃癌细胞MGC803增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)外，其余浓度竹荪多糖组中不同时间点之间的胃癌细胞MGC803增殖抑制率差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中在10～40 μg/mL浓度之间，随给药时间延长胃癌细胞MGC803的增殖抑制率逐渐增加(均P<0.05)。干预 24 h 后，与10 μg/mL相比，20、40 μg/mL竹荪多糖组胃癌细胞MGC803的增殖抑制率逐渐增加(均P<0.05)；干预48 h后，20、40 μg/mL竹荪多糖组胃癌细胞MGC803增殖抑制率高于10 μg/mL竹荪多糖组(均P<0.05)；干预72 h后，20、40、60 μg/mL竹荪多糖组胃癌细胞MGC803增殖抑制率高于10 μg/mL竹荪多糖组(均P<0.05)。见表4。

表4 干预不同时间后各浓度竹荪多糖组胃癌细胞MGC803的增殖抑制率(x±s，%)

2.5 竹荪多糖对结肠癌细胞LoVo增殖的抑制作用 20、40、60 μg/mL竹荪多糖组中，干预后48 h和72 h结肠癌细胞LoVo增殖抑制率高于干预后24 h的增殖抑制率(均P<0.05)。干预24 h后，不同浓度竹荪多糖组间结肠癌细胞LoVo增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)；干预48 h和72 h后，结肠癌细胞LoVo增殖抑制率随着竹荪多糖浓度增加而增高(均P<0.05)。见表5。

表5 干预不同时间后各浓度竹荪多糖组结肠癌细胞LoVo的增殖抑制率(x±s，%)

3 讨 论

食用菌的药用价值受到越来越多的关注，其药用价值主要体现在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、健胃、助消化、预防和辅助治疗心脑血管疾病等方面[5]。食用菌多糖作为食用菌抗癌的主要活性成分，可在刺激抗体形成的同时，提高机体防御能力，同时降低肿瘤的发生率，并且可辅助化疗药物以增效[6]，常见灰树花多糖[7]、白灵侧耳多糖[8]、灵芝多糖[9]、松口蘑多糖[10]等食用菌多糖用于抗肿瘤的研究报告。近年来关于竹荪多糖提取的研究很多[11]，但有关竹荪多糖抗肿瘤方面的实验研究报道较少。

本研究分析竹荪多糖对 5种肿瘤细胞(乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞HeLa、胃癌细胞MGC803和结肠癌细胞LoVo)增殖的抑制作用，旨在为竹荪多糖的药效学研究提供数据支持，也为食用菌的综合开发与利用提供参考。结果显示，使用一定浓度的竹荪多糖干预一定时间后，其在体外对肝癌细胞HepG2增殖的抑制率可达50%，且在干预24～72 h后，10～60 μg/mL浓度范围内的竹荪多糖对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用具有一定的时间依赖性和浓度依赖性(均P<0.05)，提示其对肝癌细胞具有较好的抑制作用，这或可为临床配伍使用治疗肝癌提供一定的参考。此外，竹荪多糖对胃癌细胞MGC803和结肠癌细胞LoVo的增殖抑制率未达到50%以上，但随着药物干预时间的延长和干预浓度的增加，肿瘤细胞的增殖抑制率有所增加，可达20%以上，这提示竹荪多糖可能对上述两种肿瘤细胞有一定的抑制作用，进一步增加药物浓度或延长干预时间是否可获得更好的抑制作用，需今后进行更为深入的研究加以论证。

然而，竹荪多糖对乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制率均低于15%，且随着竹荪多糖干预时间的延长和干预浓度的增加，肿瘤细胞的增殖抑制率并无增加趋势(均P>0.05)。竹荪多糖具有多种生物活性，这与其多糖的化学结构有一定的关系，其单糖组分多为半乳糖、葡萄糖、甘露糖，还包括微量的葡萄糖醛酸、海藻糖和痕量的核糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等[12]。本实验中未对竹荪多糖的结构、单糖组成及其醛酸等进行检测，尚不确定竹荪多糖的肿瘤抑制活性对乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制作用较差与此是否也有关联，尚需进一步研究验证。

综上所述，竹荪多糖对肝癌细胞HepG2具有较好的增殖抑制作用，且具有一定的时间依赖性和浓度依赖性，其可能对胃癌细胞MGC803和结肠癌细胞LoVo的增殖也有一定的抑制作用，这或可为竹荪多糖的综合开发与临床应用提供一定的参考。