郭小文，任青，张鑫，李敏婷，李雪玲，彭康

1 南方医科大学中西医结合医院药学部，广州 510315；2 南方医科大学中西医结合医院治未病中心

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎为主要病理特征的自身免疫性疾病，属中医学“痹病”或“历节”的范畴［1］。目前，RA 治疗方案多种多样，但其疗效及患者满意度均欠佳［2］。长期的临床实践发现，中医药具有多成分、多通路、多靶点治疗优势，目前已越来越多的用于RA 的治疗中［3］。关节活络丸（Guanjie Huoluo Pill，GJHL）是我院长期应用的治疗RA 院内制剂，具有滋补肝肾、益气养血、舒筋活络、散寒止痛之功效。我们前期共纳入106 例RA 患者，采用GJHL 治疗后达到临床治愈18例、显效34例、好转43例、无效11例，治疗总有效率高达88.62%，但GJHL 治疗RA 的具体作用机制尚不明确。2017 年6 月起，我们制备胶原诱导性关节炎（Collagen induced arthritis，CIA）模型大鼠，观察GJHL 的治疗效果，探讨其抗炎的主要药理作用机制，以期为进一步研发RA治疗新药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF 级Wistar 大鼠32 只，雄性，体质量120～150 g，购自于广州中医药大学实验动物中心，在南方医科大学中西医结合医院实验动物中心饲养，设施使用许可证号SCXK（粤）2013-0034。弗氏完全佐剂、Ⅰ型胶原蛋白水解酶（美国Sigma 公司），鸡Ⅱ型胶原蛋白（上海远慕）制备Ⅱ型胶原蛋白乳化液：在冰浴条件下，将2 mg/mL的Ⅱ型胶原蛋白溶液（将鸡II 型天然胶原溶解于0.l mol/L醋酸溶液中摇床过夜）2 mL 与等体积的完全弗氏佐剂混合，总体积为4 mL，终浓度1 mg/mL，使用电动匀浆器以25 000～30 000 r/min 进行混匀，每次2.5 min，暂停2.5 min，反复3～4 次，至形成油包水白色乳液，滴至水中不扩散。大鼠白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA 检测试剂盒（深圳欣博盛）、GJHL 由黄芪、枸杞子、淫羊藿、黄精（制）、牛膝、细辛、桑枝、秦艽、桂枝、雷公藤、丹参、鸡血藤、薏苡仁、山药、茯苓组成，由南方医科大学中西医结合医院药房提供（粤药制字Z20110010），将GJHL 溶于纯净水至浓度为0.252 g/mL。来氟米特（LEF，5 mg/片，苏州长征—欣凯制药有限公司，批号：H20060034）纯净水溶至浓度为0.525 mg/mL，PV-200 足趾容积测量仪（成都泰盟科技有限公司），EPOCH酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 CIA诱导及GJHL给予方法 32只大鼠按随机数字表法分为GJHL组、阴性对照（NC）组、空白对照（BC）组、来氟米特（LEF）组，每组各8 只，除NC 组外，其余3组大鼠参照文献［4］及鸡Ⅱ型胶原蛋白说明书制备CIA 模型：大鼠于尾根部注射0.2 mL 胶原+CFA 乳剂进行首次免疫，造模第7 天于大鼠尾根部注射0.1 mL 胶原+IFA 乳剂进行增强免疫。7 天观察并记录各组大鼠踝关节的关节炎指数（arthritic Index，AI），若AI≥4 表示造模成功。诱导成功后，GJHL组、LEF组分别予GJHL、LEF混悬液灌胃，NC、BC 组大鼠予等剂量纯净水灌胃，10 mL/kg，2 次/天，连续灌胃28 d。

1.3 各组大鼠AI、关节肿胀率测算 ①分别于灌胃第1（给药前）、7、14、21、28 天观察并记录各组大鼠踝关节的AI。单个肢体AI 评分标准为0 分：无关节红肿；1 分：踝关节或足趾的轻度红肿；2 分：踝关节的中度红肿；3 分：包括趾关节在内的全足明显红肿；4 分：多足明显红肿伴关节变形、功能障碍。每只大鼠的AI 评分最高为16 分。②分别于灌胃第1（给药前）、7、14、21、28 天采用容积法检测大鼠左右后肢体积，用大鼠足趾容积测量仪测量大鼠右后肢趾关节毛际以下的容积（mL）。计算其关节肿胀率，以第1 天测值为基值，以后每次测得的值与之相比所得比值记为关节肿胀率。

1.4 各组大鼠血清及关节滑膜成纤维细胞培养液IL-6、TNF-α 检测 ①灌胃第28 天，1 mL/200 g 腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，采用腹主动脉采血法采血，4 ℃离心，取上清，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，测量OD450值，绘制标准曲线，测算各组大鼠IL-6、TNF-α。重复3 次，取平均值。灌胃第28天时无菌条件下取出大鼠膝关节滑膜组织，参照文献［5］对滑膜细胞进行培养。取滑膜细胞培养液，采用ELISA法检测各组大鼠关节滑膜成纤维细胞培养液上清IL-6、TNF-α。

1.5 各组大鼠踝关节病理变化观察 灌胃第28 天取各组大鼠踝关节，经固定、脱钙、石蜡包埋处理后，切成5 μm 切片，进行HE 染色。光镜下观察关节滑膜细胞和血管的增生，滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润和软骨的增生及破坏等情况。踝关节病理评分参照文献［6］分别从滑膜细胞增殖、细胞侵蚀、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀评分，5 个评分总分即为病理评分。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据处理。计量资料以表示，对多个样本的均数采用方差分析进行比较，组间比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同灌胃时间点各组大鼠踝关节AI、肿胀率比较 灌胃后GJHL 组、LEF 组大鼠于第14 天开始关节红肿、畸形程度较BC 组轻，AI 评分较低（P＜0.05）。结果见表1、2。

表1 不同灌胃时间点各组大鼠踝关节AI比较（分，）

表1 不同灌胃时间点各组大鼠踝关节AI比较（分，）

注：与BC组比较，*P＜0.05；与NC组比较，△P＜0.01。

表2 不同灌胃时间点各组大鼠关节肿胀率比较（%，）

表2 不同灌胃时间点各组大鼠关节肿胀率比较（%，）

注：与BC组比较，*P＜0.05；与NC组比较，△P＜0.01。

2.2 灌胃第28 天各组大鼠血清及关节滑膜成纤维细胞培养液上清IL-6、TNF-α 水平比较 经LEF、GJHL 灌胃后，CIA 大鼠血清及关节滑膜成纤维细胞培养液上清IL-6、TNF-α 水平均较BC 组低。结果见表3。

表3 灌胃第28天各组大鼠血清及关节滑膜成纤维细胞培养液上清IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，）

表3 灌胃第28天各组大鼠血清及关节滑膜成纤维细胞培养液上清IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，）

注：与BC组比较，*P＜0.05；与NC组比较，△P＜0.01。

2.3 灌胃第28 天各组大鼠踝关节病理比较 3 组CIA 大鼠均有不同程度的滑膜细胞增生及侵蚀、炎症细胞浸润、血管翳生成、骨质破坏，但经LEF、GJHL 灌胃后，其程度及病理评分均较BC 组低（P＜0.05）。结果见表4。

表4 各组大鼠踝关节病理评分（分，）

表4 各组大鼠踝关节病理评分（分，）

注：与BC组比较，*P＜0.05；与NC组比较，△P＜0.01。

3 讨论

RA 是一种关节滑膜炎症持续存在的慢性自身免疫性疾病，常导致关节破坏畸形。目前抗炎的主要治疗手段有生物制剂、非甾体类抗炎药等，这些药物虽然能有效的控制RA 的炎症反应，但是仍有较大的毒副作用且价格昂贵，给患者带来经济负担。因此，寻找疗效确切、毒副作用小的治疗药物非常重要。RA 属于中医风湿病（痹病、痹证）范畴，中医认为基本病机是，感受风寒湿热之邪，或因日久正虚，内生痰浊，瘀血正邪相搏，使经络、肌肤、血脉，筋骨，甚则脏腑的气血痹阻，而出现肢体关节的肿胀，重着变型、僵直等症，甚则累及脏腑。《黄帝内经》记载外邪侵入人体是导致痹病发生的重要条件。历代众多医家通过临床观察，总结出风寒湿三气中但见二气复合侵入体内，即可致痹。“正气存内，邪不可干”，痹病发病除外因外，其内因不可小觑，而痹病的主要内因是因为肝肾不足、气血亏虚。我院院内制剂关节活络丸内外因兼顾组方，方以黄芪配枸杞补益气血；淫羊藿配黄精、续断、牛膝温补肝肾，强筋壮骨；细辛、桑枝、秦艽、雷公藤、桂枝温散风寒、祛风通络；丹参、鸡血藤活血通络；薏苡仁、山药、茯苓健脾祛湿、消肿。黄芪、淫羊藿、枸杞子、续断、牛膝等阴阳共进，补益肝肾，强筋健骨，还可增强对雷公藤、细辛之毒性的耐受力，防其毒伤正之弊。全方标本兼顾，风寒湿并祛，并作成丸剂缓图，对RA 患者的关节肿胀、疼痛、关节僵硬等症具有较好疗效，临床应用广泛。其起效的作用机制并未明确。

CIA 大鼠是以慢性、多发性末端关节炎主的免疫性炎症模型，能够很好的模拟人RA 炎症反应，在研究免疫反应、新药研发及疗效评价等方面都具有明显的优势［7］。CIA 大鼠致敏第7 天开始出现轻度炎症，第14 天炎症细胞浸润明显，第21 天出现血管翳形成及软骨破坏，5～6 周后才出现明显的骨侵蚀现象［8］，因此对其进行药物干预28 天可以明显反应出药物的抗炎作用及软骨保护作用。RA 病理改变主要累及关节滑膜，表现为滑膜炎。本实验结果表明，GJHL 能够明显减轻CIA 的红肿程度及关节肿胀率，疗效与LEF类似。

IL-6是多效性前炎症细胞因子，在RA炎症过程中起着重要作用，主要包括：影响成骨细胞与破骨细胞的平衡，最终导致骨质疏松；与受体或者多种炎症因子结合后作用于多条信号通路而增强炎症反应［9］。RA 患者的血清和滑膜液中的IL-6 水平具有所升高，且其水平与RA 的疾病活动度和影像学的关节破坏程度正相关。进一步研究［9］发现，RA 的关节外症状如贫血、疲劳、急性反应蛋白升高等也与IL-6 的全身系统性作用密切相关。这些均提IL-6信号转导通路是RA 发病过程中起着重要的作用，也可能是治疗RA 的靶点。本实验中GJHL 能降低CIA 大鼠血清和滑膜细胞培养液中IL-6 的含量，提示GJHL起到抗炎作用的作用机制与IL-6相关。

TNF-α主要由巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞产生，滑膜衬里层的非炎症细胞滑膜巨噬细胞也能产生［10］，其参与的诱导炎性细胞聚集和激活、促进滑膜细胞增殖、诱导成纤维滑膜细胞产生骨和软骨破坏的细胞因子和蛋白酶、刺激巨噬细胞产生其他细胞因子等活动导致RA 患者出现一系列的病理变化［10］，它与IL-6又能相互影响，并都参与了骨质破坏的过程［11］。因此，抑制TNF-α 的分泌也能很好的控制住炎症过程及骨质破坏情况。本实验结果显示，GJHL 能降低CIA 大鼠血清和滑膜细胞培养液中TNF-α 的含量，这也说明GJHL 的抗炎作用很可能是通过抑制TNF-α的分泌实现的。

综上所述，GJHL 对CIA 大鼠关节炎具有良好的治疗效果，GJHL 溶液灌胃可降低CIA 大鼠四肢AI、关节肿胀率、踝关节病理评分，其机制可能为GJHL降低血清及关节滑膜组织IL-6、TNF-α表达。