侯梦瑶 邵明琨 祁文瑾

昆明医科大学第一附属医院妇产科，云南省昆明市 650000

外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是由假丝酵母菌引起的女性最常见的下生殖道感染性疾病之一，其典型症状为外阴瘙痒、红肿、豆腐渣样的白带并带有异味等，据统计有75%的女性一生中至少有过一次VVC感染。其中50%的女性会有复发，5%～8%1年内症状复发4次或4次以上成为复发型外阴阴道假丝酵母菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)患者[1]。假丝酵母菌是一种机会致病菌，健康状态下，在阴道局部的微环境中，假丝酵母菌、乳酸杆菌及宿主处于共生状态；怀孕、糖尿病、月经期间或者口服避孕药等诱因，都有可能导致阴道局部的菌群失调、免疫状态等发生改变，从而促使假丝酵母菌从酵母相向菌丝相转变而致病；近年来抗生素的滥用以及VVC的不规范治疗，导致了耐药菌株的出现从而使VVC的复发率逐年增加[2]，相比于彻底治疗，更重要的是如何预防，这样不仅可以让患者的生活质量得到提高还可以节约医疗资源。要想达到这一目的，首先要掌握VVC的发病机理，其中，局部免疫一直是研究者们关注的重点，本文着重对近年来研究NLRP3炎性小体调控机制及其在VVC中的作用进行总结。

1 NLRP3炎性小体

NLRP3炎性小体主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞的胞浆中，在受到生物及非生物刺激后组装产生。它是由NLRP3蛋白、衔接子凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain，ASC)和效应子半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1前体(procaspase-1)组成的多蛋白复合物，其中，ASC是NLRP3蛋白和procaspase-1的桥梁[3]。当受到损伤因子刺激后，NLRP3蛋白与ASC相互作用启动炎性小体的形成，且ASC同时募集并激活procaspase-1以产生活性的caspase-1，然后剪切诱导pro-IL-1β和pro-IL-18形成具有生物学活性的IL-1β和IL-18，从而触发一系列的炎症反应[3-4]。现有研究显示，NLRP3炎性小体的激活分两个阶段：第一阶段，Toll样受体(TLRs)识别各种应激因素并激活NF-κB，从而促使pro-IL-1β和pro-IL-18产生；第二阶段，组装NLRP3炎性复合体，然后诱导IL-1β和IL-18的成熟与分泌[3,5]。它们是受到复杂多样的触发因素影响和调控的。

NLRP3炎性小体激活的因素：(1)K+外流：细胞内K+浓度降低被视为NLRP3炎性小体激活的常见触发因素。细胞内低钾导致线粒体损伤后，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)释放激活NLRP3炎性小体。(2)Ca2+内流：研究报道细胞内Ca2+增加是NLRP3炎性小体激活的必需条件，ATP与膜受体P2X7R(ATP受体)结合，使Ca2+内流；一方面，Ca2+的过量释放会导致线粒体Ca2+超载和线粒体损伤，从而导致mtROS释放并激活NLRP3炎性小体，另一方面，细胞质中的Ca2+增加会促进内质网中Ca2+的释放，增加的Ca2+会与钙敏感受体(Calcium-sensing receptor，CASR)结合，激活NLRP3炎性小体[6]。(3)Cl-外流：K+外流后ROS释放介导Cl-胞内通道(CLIC)打开，导致Cl-外流诱导ATP促发NIMA相关激酶7(NIMA-related kinase 7,NEK7)与NLRP3蛋白结合进而激活NLRP3炎性小体[7]。(4)Na+内流：当Na+通道被激活打开时，Na+和水内流导致细胞肿胀，同时水的流入导致细胞内离子平衡被打破，从而促使K+阈值降低激活NLRP3炎性小体，但该机制并不是NLRP3激活的必需机制。与离子转移相伴随的溶酶体、线粒体DNA损伤以及ROS释放等都是NLRP3炎性小体的激活因素[4]。此外，在肝衰竭机制研究中发现当炎症反应激活时，反式高尔基体网络(Trans-Golgi network,TNG)分解形成分散的反式高尔基体网络(dispersed trans-Golgi network,dTNG)，其膜中富含的负电荷磷脂分子Ptdins4p可以招募细胞质中带正电荷的NLRP3蛋白，诱导其组装成活化的NLRP3炎性小体，倘若阻止dTNG的形成，可以抑制NLRP3的募集和激活[8]。

NLRP3-/-的实验模型都表现出了对疾病的易感性，但是NLRP3过度激活又会对宿主造成损伤[3]，因此，抑制NLRP3炎性小体的过度激活也显得至关重要。到目前为止，白介素增强结合因子2(Interleukin-enhanced binding factor 2,ILF2)虽然无法抑制ASC、caspase-1活性和阻断pro-IL-1β、pro-caspase-1的产生，但是它不仅可以通过与NLRP3蛋白的NAD结构域相互作用抑制其活性，还可以抑制ATP诱导的IL-1β活化从而来控制炎症[9]。I型干扰素可以下调P2X7R和转录激活因子1(STAT1)途径，从而抑制NLRP3炎性小体；PYD-only蛋白(PYD-only proteins，POPs)和CARD-only蛋白(CARD-only proteins，COPs)可以竞争性的与ASC结合，扰乱ASC、NLRP3与caspase-1的组装，从而抑制NLRP3炎性小体的活化；内源性的NO也可以抑制NLRP3的活化，防止炎症反应的过度激活[4]。

2 假丝酵母菌对NLRP3炎性小体的作用

近年的研究显示，真菌编码的Sap、HWP1、ECE1基因、细胞壁中的葡聚糖以及AhR(芳基烃受体)/IL-22/IL-18轴等对NLRP3炎性小体的活性调节都有作用(图1)，下面就来一一说明。

分泌型天冬氨酸蛋白酶(Secretion of aspartic proteases，Saps)可促进上皮细胞的黏附和损伤，它的胞外蛋白水解酶活性长期以来被认为是致病性白色念珠菌的重要毒力特征。Sap基因型主要分为Sap 1～10等，其中，Sap 1～8被分泌到细胞外，而Sap 9～10则与细胞膜或细胞壁有关。Sap 1～3在较低pH值下具有最高活性，而Sap 4～6在较高pH值下具有最高活性，pH范围在2.0～7.0之间。其中，Sap2和Sap6是目前研究最多的两个基因型[10]。有研究发现[11]，念珠菌处理后1h Sap2诱导NLRP3炎性小体中的caspase-1激活强于Sap6，4h后两者均达高峰，但Sap2和Sap6对IL-1β和IL-18的诱导率相近，因此认为caspase-1的延迟活化并不影响pro-IL-1β的激活；同时还发现Sap2和Sap6提供了直接激活NLRP3炎性小体的第二信号，加重了炎症反应和中性粒细胞的募集。Sap2、Sap6内在化后可通过Ⅰ型IFN活化caspase-11然后激活caspase-1进而促进IL-1β的成熟与分泌，使用caspase-11的抑制剂IC-11后发现，虽然NLRP3炎性小体对caspase-1的激活作用不受影响，但IL-1β的分泌量明显减少，说明两者对caspase-1的活化都是必不可少的，NLRP3炎性小体主要为前期的作用，后期则需要caspase-11的辅助维持[12]。由此可见，Sap作为白假丝酵母菌的主要毒力之一，对激活NLRP3炎性小体从而诱发固有免疫对清除致病菌有着至关重要的作用。

HWP1基因编码细胞壁蛋白，是念珠菌菌丝发育所必需的，促进念珠菌能够更好地黏附在宿主的上皮细胞上；另外，ECE1在感染时高表达，与念珠菌对宿主细胞的损伤机制密切相关，HWP1和ECE1在正常人阴道内几乎不存在，而在VVC中过表达[13]。念珠菌侵入人体后可被巨噬细胞吞噬，但不会被清除，而是大部分都会产生菌丝，然后突破细胞屏障，逃逸宿主的清除作用，并且菌丝对激活NLRP3炎性小体至关重要[14]。因此，也提示了NLRP3炎性小体在VVC中扮演着重要角色。

ECE1基因对机体的损伤作用有两个方面。一方面，ECE1-Ⅲ是ECE1P的活性区域，有上皮免疫激活剂和溶细胞剂的作用，对上皮细胞的损伤发生迅速，可引起内向电流(Ca2+)；另一方面，ECE1编码的念珠菌毒素是一种真菌肽毒素，且肽羧基末端带正电荷，这与宿主膜负电荷组分相互作用是促进病变形成的关键[15]。Rogiers等人[16]发现，念珠菌毒素可以使细胞膜上形成小孔，从而导致K+外流后激活NLRP3炎性小体，促进巨噬细胞分泌特异性的IL-1β，但是对缺乏NLRP3炎性小体巨噬细胞没有作用，说明念珠菌毒素对机体的免疫损伤作用需要通过NLRP3炎性小体来完成。Lydia Kasper等[14]研究发现ECE1基因缺乏时IL-1β的水平降低，也进一步说明ECE1基因介导的NLRP3炎性小体激活对念珠菌感染后人体产生免疫应答必不可少。因此，ECE1基因在假丝酵母菌致病方面发挥着非常重要的作用，不仅可以分泌念珠菌素直接导致细胞膜穿孔，还可以通过激活NLRP3炎性小体引起阴道局部的高炎症反应从而造成更进一步的损伤。

β-葡聚糖是真菌和酵母细胞中最丰富的成分，具有不同的免疫调节特性，可以被C型凝集素-1(dectin-1)识别，两者结合会触发络氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)的募集而后激活NF-κB，从而参与pro-IL-β的合成和念珠菌诱导的炎性小体激活机制[11,17]。因此，β-葡聚糖是先天免疫和NLRP3激活的一个有关因素[18]。

NLRP3炎性小体在VVC中虽然有助于念珠菌的清除但会导致过度的炎症反应，有研究报道[19]，NLRP3炎性小体在多种自身炎症性疾病中有至关重要的作用，如系统性红斑狼疮等，VVC发病过程中，若NLRP3炎性小体被过度激活，IL-1β释放增加，会导致中性粒细胞的过度聚集，此时，不仅无法有效清除病原菌，还可能因此而产生高炎症反应，对机体造成损伤。推测RVVC反复发作的部分原因可能是由NLRP3炎性小体造成了阴道局部免疫系统功能紊乱，使得IL-1β对致病性白念珠菌感染的生物活性增强，因此，控制NLRP3炎性小体的过度激活也许是一种新的治疗方向。NLRC4可以通过减少NLRP3炎性小体募集的中性粒细胞从而减轻病理反应[20]。3-IAID(AhR的激动剂吲哚3-醛，由阴道内乳酸杆菌分泌产生)促进IL-22分泌从而活化NLRC4，然后刺激IL-1的受体拮抗剂(IL-1Ra)分泌进而抑制NLRP3炎性小体活性和IL-1β的产生。此外，当IL-18含量较低或者缺乏时，IL-22/NLRC4活力缺失，导致NLRP3/IL-1β的炎症反应不受控制而继续[21]。说明这个轴存在反馈调节机制，且对NLRP3炎性小体起抑制作用，将炎症反应控制在一定范围内，从而保护宿主组织不会被过度损伤。

另外，Jaeger等人[22]发现NLRP3的12/9基因型与RVVC的易感性有关，含这个基因型的患者与健康妇女相比阴道分泌物内IL-1β的生成量更高，IL-1Ra的含量降低，IL-18的水平持平，从而出现阴道高炎症状态，更进一步说明NLRP3炎性小体在VVC发病机制中的重要作用。

Frank Lvan de Veerdonk等人[23]研究发现，caspase-1和ASC诱导了最佳的抗真菌保护，即Th1和Th17应答；Th1通过增强吞噬作用抑制细胞内病原体的感染，IFN-γ是其主要的效应因子。Th17主要分泌IL-17、IL-22等细胞因子，其中IL-17是联系固有免疫和适应性免疫的重要因子，不仅可以刺激趋化因子及其他细胞因子的产生，还可以诱导集落刺激因子(CSF)及其受体表达，促进中性粒细胞生成并诱导防御素产生；这对播散性念珠菌病的宿主防御至关重要，因此表明NLRP3是先天免疫和适应性免疫的桥梁。此外，该研究还发现感染早期中性粒细胞对裂解pro-IL-18和pro-IL-1β有一定的作用。另一个研究[17]也发现，β-葡聚糖刺激NLRP3炎性小体的产生对体液免疫中B细胞的直接激活是必需的，且对Th1和Th2的分化必不可少，这些作用与NLRP3炎性小体在连接先天免疫和适应性免疫中具有重要作用的说法是一致的。

总而言之，白念珠菌的Saps、ECE1、β-葡聚糖等毒力在其黏附并侵入宿主的过程中都扮演着各自重要的角色，且都可以通过介导K+外流、Ca2+内流、ROS产生以及溶酶体损伤等机制来激活NLRP3炎性小体，诱导IL-1β和IL-18的分泌从而启动机体的免疫防御机制来抵抗致病菌。这个过程需要严密的调控将炎症反应控制在清除病原体的同时不对机体造成额外的损伤。此外，机体的免疫系统虽然分为先天性免疫和适应性免疫，但两者不是独立存在的，NLRP3炎性小体就是连接两者的桥梁。因此，将先天性免疫和适应性免疫联合研究对VVC的发病机制可能有更进一步的了解，对攻克RVVC这一大难关奠定坚实的基础。