袁凯旋，张裕群，黄爱伟，叶龙，陈晓丽，陈卓曦，刘素玲，顾兵

广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080

近年来，随着糖皮质激素、免疫抑制剂、广谱抗菌药物的广泛应用及肿瘤化疗、器官移植等危险因素增多，侵袭性念珠菌病发病率呈明显上升趋势[1]。全球真菌感染行动基金（https://gaffi.org/）数据显示每年住院及危重患者感染念珠菌的人数超过750 000，每年估计死亡人数超过350 000。国外多中心研究数据显示，近年来以近平滑念珠菌为代表的非白色念珠菌在侵袭性感染中的分离率逐渐升高，且耐药率高于白念珠菌[2～3]。中国侵袭性真菌耐药监测网（https://www.chifnet.com/）2010～2014年的数据显示，近平滑念珠菌在侵袭性真菌感染中占比18%，仅次于白念珠菌及热带念珠菌[4]。

近平滑念珠菌复合群主要包括近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、似平滑念珠菌（Candida metapsilosis）和拟平滑念珠菌（Candida orthopsilosis）[5]，其可借由医护人员及相关工作人员的手部皮肤接触，引起院内传播。与其他念珠菌比较，近平滑念珠菌易附着于各种装置和材料的表面、易在高糖的肠外营养液中存活，从而增加感染风险[3]。尽管近平滑念珠菌复合群通常对大多数抗真菌药物敏感，但有研究显示其对棘白菌素和唑类抗真菌药物的敏感性正在下降[6]，因此对唑类抗真菌药物耐药的近平滑念珠菌需引起临床重视和关注。但目前关于近平滑念珠菌复合群临床可用的抗真菌药物的敏感性数据有限，且不同菌种的抗真菌药物敏感性亦可能存在差异。基于此，本研究探讨了4种临床常用的抗真菌药物（氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑）对近平滑念珠菌、似平滑念珠菌和拟平滑念珠菌的抗真菌体外药敏特点，旨在为临床治疗、真菌耐药监测和流行病学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2020年1月～2022年7月期间本院278例侵袭性真菌感染患者临床分离的非重复近平滑念珠菌复合群278株。所有菌株均经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix～assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI～TOF MS）和形态学鉴定（表1）。

表1 侵袭性真菌感染患者的一般资料 n（%）

续表

1.2 菌株复核

根据Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取DNA，利用真菌通用引物对内转录间隔区进行PCR扩增，引物序列为ITS1：5’～TCCGTAGGTGAACCTGCGG～3’；ITS4：5’～TCCTCCGCTTATTGATATGC～3’。反应总体积为50μl：Taq PCR Master Mix 25μl、DNA模板5μ l、0.2μmol/L 上 下 游引物各2 μ l、ddH2O 16 μ l。扩增条件：94℃ 预变性3min；94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。使用Contig Express 9.1软件将两端序列进行拼接和手动矫正后，在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和MYCOBANK数 据库（https://www.mycobank.org/）上进行比对，种、属信息鉴定原则参照相关标准[7]。

1.3 抗真菌药物敏感性试验

依照ATB FUNGUS 3试剂盒（法国生物梅里埃公司）说明书进行操作。挑取培养纯菌落，使用氯化钠溶液制备成2.0MCF的菌悬液，取20μl菌悬液置入含培养液的安瓿瓶中，用吸管混匀，在每个杯状凹槽中加入135μl混匀的培养液，在有氧、（35±2）℃的环境中，湿盒培养（24±2）h。采用近平滑念珠菌ATCC22019作为质控菌株。

1.4 判断标准

将试验条放置于黑暗背景下进行肉眼判读。根据美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2020 年更新的 M59[8]和 M60[9]文件中相关判读标准，参照临床折点（clinical breakpoint， CBPs）和流行病学折点（epidemiological cutoff value，ECV）进行结果解释。两性霉素B完全抑制真菌生长的浓度为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）；与对照组比较，氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的真菌生长抑制率超过80%时的药物浓度为各药物相应的MIC。当MIC≤ECV时，该菌株为未获得相关药物的耐药机制或突变性耐药的野生型（wild～type，WT）菌株；当MIC＞ECV时， 该菌株为获得相关药物的耐药机制或有突变耐药的非野生型（non～wild～type，NWT）菌株。

本研究中具体标准如下：①近平滑念珠菌：两性霉素B（MIC≤1 μ g/ml为WT；MIC＞1 μ g/ml为NWT），氟康唑（MIC≤2 μ g/ml为敏感；MIC =4 μ g/ml为剂量依赖性敏感；MIC≥8 μ g/ml为耐药），伊曲康唑（MIC≤0.5 μ g/ml为WT；MIC＞0.5 μ g/ml为NWT），伏立康唑（MIC≤0.125 μ g/ml为敏感；0.25 μ g/ml≤MIC≤0.5 μ g/ml为中介；MIC≥1 μ g/ml为耐药）。②似平滑念珠菌：两性霉素B（MIC≤1 μ g/ml为WT；MIC＞1 μ g/ml为NWT），氟康唑（MIC≤4 μ g/ml为WT；MIC＞4 μ g/ml为NWT），伊曲康唑（MIC≤1 μ g/ml为WT；MIC＞1 μ g/ml为NWT），伏立康唑（MIC≤0.06 μ g/ml为WT；MIC＞0.06 μ g/ml为NWT）。③拟平滑念珠菌：两性霉素B（MIC≤2 μ g/ml为WT；MIC ＞2 μ g/ml为NWT），氟康唑（MIC≤2 μ g/ml为WT；MIC＞2 μ g/ml为NWT），伊曲康唑（MIC≤0.5 μ g/ml为WT；MIC＞0.5 μ g/ml为NWT），伏立康唑（MIC≤0.12 μ g/ml为WT；MIC＞0.12 μ g/ml为NWT）。④近平滑念珠菌复合群的CBPs和ECV可参考近平滑念珠菌。

1.5 统计学方法

通过每种药物对不同菌株的MIC值，计算能抑制50%菌株生长所需的MIC（MIC50）、抑制90%菌株生长所需的MIC（MIC90）、MIC的几何均数（geometric mean，GM）、WT菌株或敏感菌株的占比。不同抗真菌药物的MIC比较采用独立样本t检验，敏感菌株或WT菌株占比的比较采用χ2检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 菌株复核结果

通过ITS区序列分析，278株受试菌株测序结果与MALDI～TOF MS和形态学鉴定结果相符，即近平滑念珠菌213株（76.62%）、似平滑念珠菌43株（15.47%）、拟平滑念珠菌22株（7.91%）。

2.2 一般资料

278例侵袭性真菌感染患者中，男性179例（64.39%），女性99例（35.61%）；年龄17天～96岁，平均年龄（60.88±17.71）岁；病原菌主要来源于创面分泌物（85株，30.58%）和洁净中段尿（67株，24.10%）；患者主要分布于外科病区（89例，32.01%）、内科病区（79例，28.42%）和ICU病区（77例，27.70%）。详见表1。

2.3 抗真菌药物敏感性结果

在复合群水平上，278株受试菌株中，对氟康唑耐药的有16株（5.76%），剂量依赖性敏感的有6株（2.16%），敏感的有256株（92.09%）；4株为伊曲康唑NWT菌株（1.44%）；对伏立康唑耐药的有9株（3.24%），中介的有7株（2.52%）；所有菌株均为两性霉素B的WT菌株（100.00%）。

在种水平上，近平滑念珠菌（213株，100.00%）、似平滑念珠菌（43株，100.00%）和拟平滑念珠菌（22株，100.00%）均为两性霉素B的WT菌株。氟康唑对近平滑念珠菌和似平滑念珠菌的MIC范围均为1～128μg/ml，MIC50均为1μg/ml，MIC90均为 2μg/ml，GM 分别为 1.2477、1.2532μg/ml，二者比较无统计学差异（P＜0.05）。近平滑念珠菌中，199株（93.43%）为氟康唑敏感菌株，10株（4.69%）为氟康唑耐药菌株；似平滑念珠菌中，42株（97.67%）为氟康唑WT菌株，1株（2.33%）为NWT菌株（氟康唑 MIC为128μg/ml）；拟平滑念珠菌中，氟康唑的MIC范围 为 1～16μg/ml，MIC50为 1μg/ml，MIC90为16μg/ml，GM 为 1.6550μg/ml，15 株（68.18%）为氟康唑WT菌株，与其他两种菌比较有统计学差异（P＜0.05）。伊曲康唑对近平滑念珠菌、似平滑念珠菌和拟平滑念珠菌亦表现出较好的抑菌活性，MIC50均为0.125 μ g/ml，且各菌种中95%以上菌株均为伊曲康唑WT菌株（P＞0.05）。伏立康唑对近平滑念珠菌和似平滑念珠菌的MIC50、MIC90均为0.06 μ g/ml，GM分别为0.0688、0.0672 μ g/ml，其中204株（95.77%）近平滑念珠菌为伏立康唑敏感菌株，42株（97.67%）似平滑念珠菌为伏立康唑WT菌株；伏立康唑对拟平滑念珠菌的 MIC50为 0.06 μ g/ml，MIC90为 0.5 μ g/ml，GM为0.1213 μ g/ml，GM与其他两种菌比较有统计学差异（P＜0.05），仅16株（72.73%）拟平滑念珠菌为伏立康唑WT菌株，与其他两种菌比较有统计学差异（P＜0.05）。详见表2。

表2 近平滑念珠菌复合群对4种抗真菌药物的体外敏感性结果

续表

3 讨论

近平滑念珠菌复合群是人类皮肤黏膜、消化道、生殖道内的正常定植菌群，在某些危险因素下可侵犯皮肤、黏膜和内脏，表现为急性、亚急性或慢性炎症，大多为继发性感染，目前已经成为侵袭性念珠菌病的第二大病原体[3，5]。多项研究发现复合群中最常见的菌种为近平滑念珠菌，其次为似平滑念珠菌[2，5～6]。本研究纳入分析的 278 株菌株以近平滑念珠菌（76.62%）为主，似平滑念珠菌（15.47%）次之，拟平滑念珠菌（7.91%）最少。皮肤表面是近平滑念珠菌最主要的分离部位[10]，本研究中创面分泌物是其最主要的标本来源，这可能也是该菌易导致机会性自身感染的原因。近平滑念珠菌感染在66岁以上人群中更常见（128例，46.04%），且主要分布于外科、内科和ICU病区，临床需提高警惕并积极采取措施预防特殊人群感染侵袭性念珠菌。

美国传染病学会2016年更新的《念珠菌病处理临床实践指南》（Clinical Practice Guideline for the Management of Candidiasis）中推荐，氟康唑可作为侵袭性念珠菌病的一线治疗药物，伏立康唑可作为替代药物[11]。近平滑念珠菌复合群中各菌种的生物学特性存在一定差异，对抗真菌药物的体外敏感性亦不尽相同。本研究采用ATB FUNGUS 3法对278株近平滑念珠菌复合群内的3种菌种进行体外药敏试验，氟康唑总体耐药率为5.76%，伏立康唑总体耐药率为3.24%，该结果与SENTRY真菌监测项目连续20年的监测数据结果[12]相近，即近平滑念珠菌对氟康唑的耐药率为2.5%～5.5%；对伏立康唑的耐药率与张丽等[13]的研究结果相近。在种水平上，两性霉素B对3种菌种均表现出良好的抑制活性，所有分离株均为WT菌株，与以往的研究结论一致[5～6]；伊曲康唑亦表现出较好的抗菌活性，3种菌种中95%以上菌株均为敏感菌株或WT菌株；氟康唑和伏立康唑的抗菌活性存在种间差异，93.43%的近平滑念珠菌为氟康唑敏感菌株，97.67%的似平滑念珠菌为氟康唑WT菌株，仅68.20%的拟平滑念珠菌为氟康唑WT菌株，可见氟康唑对近平滑念珠菌和似平滑念珠菌表现出较好的抗菌活性，而对拟平滑念珠菌的抗菌活性较差；伏立康唑对近平滑念珠菌和似平滑念珠菌亦表现出较好的抗菌活性，对拟平滑念珠菌的抗菌活性则较差。该结果提示不同药物对不同菌株的体外抗菌活性不同，故准确鉴定菌种、开展真菌药敏试验、准确判读药敏结果对临床合理使用抗菌药物具有重要意义。本研究中，256株（92.08%）菌株对氟康唑敏感（MIC≤2μg/ml），部分菌株敏感性较低，其中，氟康唑对10株（4.69%）近平滑念珠菌MIC范围为8～128μg/ml；对1株（2.33%）似平滑念珠菌的MIC为128μg/ml；对5株（22.73%）拟平滑念珠菌的MIC范围为8～16μg/ml。临床应警惕对氟康唑敏感性较低的分离株的出现，且菌株对部分唑类药物可能存在交叉耐药现象[14]，应引起临床重视。随着质谱、分子测序等技术的发展，实验室可实现对拟平滑念珠菌和似平滑念珠菌的准确鉴定，但由于临床分离率低、药敏数据较少，二者的药敏特点目前尚无定论。有研究发现，与近平滑念珠菌比较，似平滑念珠菌的伏立康唑NWT菌株分离率较高[15]，且似平滑念珠菌与拟平滑念珠菌均对氟康唑表现出高敏感性[16]。本研究中，与近平滑念珠菌和似平滑念珠菌相比，拟平滑念珠菌的氟康唑NWT菌株分离率最高（7株，31.82%），伏立康唑NWT菌株分离率次之（6株，27.27%）。但本研究纳入的菌株数较少，相关结论还需进一步增加样本量、多中心联合证实。

综上所述，4种抗真菌药物对近平滑念珠菌复合群的不同菌种的抗菌活性存在差异。两性霉素B和伊曲康唑对复合群内3种念珠菌均表现出较好的抗菌活性，但氟康唑和伏立康唑的抗菌活性则存在种间差异，表现为二者对拟平滑念珠菌的抗菌活性较差。因此，对近平滑念珠菌复合群进行菌种鉴定和开展抗真菌体外药敏试验对临床合理使用抗菌药物具有重要意义，也可为临床治疗、真菌耐药性检测和流行病学研究提供参考。