张欣雨，王智宇，赵文元，马保录，陶 涛

(1.青海省交通医院泌尿外科，青海西宁 810008；2.郑州大学第一附属医院泌尿外科，河南郑州 450000；3.青海大学附属医院泌尿外科，青海西宁 810008)

膀胱癌为泌尿系统高发恶性肿瘤之一，其早期症状不明显，多数患者确诊时即为晚期，肿瘤进展快，易发生转移、复发，预后情况较差[1-2]。随着医疗技术不断发展，膀胱癌发病机制逐步清晰，化疗仍是不可替代的治疗方法[3]。顺铂等化疗药物抵抗和耐药是影响其应用效果和预后的重要因素之一，复发和耐药是膀胱癌治疗面临的重要难题[4-5]。糖蛋白-130(glycoprotein-130，GP130)为跨膜蛋白，为多个致癌基因中心点，影响肿瘤的侵袭、转移、凋亡和增殖等[6]。因此，GP130与膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等均可能相关。为证实这一假设，本研究检测GP130在膀胱癌中的表达水平并分析其与膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和顺铂敏感性的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2018年1月至2020年5月收治的膀胱癌手术治疗患者32例为研究对象，纳入标准：患者均经病理检查确诊膀胱癌，采用腹腔镜膀胱癌根治性切除手术治疗，检查完善，临床资料齐全。排除标准：排除术前经其他抗癌治疗患者、复发性膀胱癌患者、合并其他肿瘤疾病患者、合并自身免疫系统疾病患者、合并肝肾功能疾病患者、合并心血管疾病患者等。研究符合伦理学标准且经伦理学委员会同意。32例膀胱癌手术治疗患者中男性20例，女性12例；年龄55～76岁，平均(65.68±6.65)岁；膀胱尿路上皮细胞癌29例、鳞状细胞癌2例、腺细胞癌1例；组织分级为G1分级患者6例、G2分级患者21 例、G3分级患者5例；术后TNM分期为T2N0M0患者29例、T3N0M0患者1例、T3N1M0患者2例。

1.2 主要试剂和仪器膀胱癌T24细胞购自中国科学院上海细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司。Lipofectamine 3000、RNA提取试剂盒、RNase Free 蒸馏水等均购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。siRNA-GP130、siRNA-NC、GP130、β-actin引物等均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。兔抗人GP130抗体、二抗、ECL试剂盒、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等均购自上海信帆生物科技有限公司。Transwell小室、蛋白质提取试剂盒购自美国BD公司。GP130、β-actin等BCA试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。顺铂、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(microenzyme reaction of tetramethylazazole， MMT)试剂盒均购自美国Sigma-Aldrich公司。采用德国艾本德5331型聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增仪、美国Bio-rad MODEL680型酶标仪、日本Olympus CKX31-A11PHP型倒置显微镜等仪器。

1.3 实验方法

1.3.1免疫组化检测 免疫组化法检测膀胱癌组织和癌旁组织的GP130表达水平。膀胱癌组织和癌旁组织标本均常规进行石蜡包埋并切为厚度4 μm的连续切片，进行相应标记后进行免疫组化检测。二甲苯浸泡20 min脱蜡，以体积分数为100%、95%、85%、75%的乙醇梯度处理，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗涤3 min并进行3次重复操作，行微波炉EDTA抗原修复，PBS洗涤3 min并进行3次重复操作，体积分数为3%的过氧化氢室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗涤3 min并进行3次重复操作，山羊非免疫血清封闭10 min，弃去血清，添加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，弃去一抗，PBS洗涤3 min并进行3次重复操作，滴加二抗，室温孵育10 min，PBS洗涤3 min并进行3次重复操作，滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS洗涤3 min并进行3次重复操作，行二氨基联苯胺显色、苏木精复染细胞核，体积分数为75%、85%、95%、100%的乙醇梯度各处理3 min，二甲苯透明并进行中性树脂封片。显微镜下随机选取5个视野(×200)观察，GP130主要表达于细胞质，以出现浅黄色、棕色或深棕色染色为细胞染色阳性，计算每个视野中100个细胞中阳性染色细胞数比例，阳性细胞染色比例超过5%为表达阳性。

1.3.2脂质体转染 膀胱癌T24细胞于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基进行传代培养，在37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱中，进行传代培养，每2～3 d/次，并取对数生长期细胞进行实验研究。根据Lipofectamine 3000说明书，将siRNA-GP130(siRNA-GP130组)、siRNA-NC(siRNA-NC组)转染细胞，并设立空白对照组(不进行转染操作)，每组设6个复孔。

1.3.3PCR检测 PCR检测各组GP130 mRNA水平。转染后48 h，取膀胱癌T24细胞进行PCR检测，根据RNA提取试剂盒进行总RNA提取，经反转录试剂盒逆转录形成cDNA，进行逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)反应，引物序列如下，GP130：正向5′-TACGAATGGCAGCATACACAGA-3′；反向5′-GCTAAGCAAACAGGCACGACT-3′。β肌动蛋白(β-actin)：正向5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′；反向5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。10 μL反应体系如下：SYBR II GREEN 5 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA 2 μL、RNase Free 蒸馏水 2.2 μL。反应程序为95 ℃预变性0.5 min、95 ℃变性1 min、60 ℃退火0.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共40个循环后72 ℃延伸10 min，反应产物进行琼脂凝胶电泳，以β-actin作为内参，通过2-ΔΔCt算法进行GP130 mRNA相对表达量计算。

1.3.4Western blotting检测 蛋白质印迹法(Western blotting) 检测各组GP130 蛋白水平。转染后48 h，取膀胱癌T24细胞常规提取总蛋白质，蛋白上样60 μg，通过12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离后电转至聚偏二氟乙烯膜，50 g/L脱脂牛奶封闭1.5 h，添加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，弃去一抗，加入含辣根过氧化物酶的二抗，室温孵育2 h，ECL试剂盒暗室显影，Image J 软件分析处理蛋白灰度值，以目标GP130 蛋白灰度值与β-actin灰度值比值为最终检测结果。

1.3.5MMT法检测 MMT检测各组细胞增殖情况。取对数生长期膀胱癌T24细胞，1×104个/孔接种至96孔板培养24 h，加入20 μL 的5 μg/L MTT试剂，37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中孵育4 h，添加150 μL DMSO震荡，酶标仪读取各孔450 nm波长处吸光度(A)，每组均设3个复孔结果取平均值，并设空白对照，空白对照细胞抑制率设定为0，三组细胞抑制率计算公式为“细胞抑制率=[1-(A目标组/A空白对照)]×100%”

1.3.6迁移和侵袭能力检测 取对数生长期膀胱癌T24细胞，制成2×104/mL细胞悬液，通过划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力。迁移测定：Transwell上室接种200 μL细胞悬液，下室接种600 μL含血清培养基，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中孵育24 h，无菌棉签除去上层膀胱癌T24细胞并充分清洗，40 g/L多聚甲醛固定0.5 h，结晶紫染色10 min，染色细胞素即迁移细胞素。侵袭测定是以1∶5比例加入RPMI 1640培养液稀释Matrigel，涂覆于Transwell上室，干燥后根据迁移测定步骤进行后续操作，计算侵袭细胞数。

1.3.7顺铂敏感性检测 将膀胱癌T24细胞接种于96孔板中，5×103个/孔，通过RPMI 1640培养基培养膀胱癌T24细胞孵育过夜，通过含0.5～1.5 μmol/L(梯度间隔0.1 μmol/L)顺铂的RPMI 1640培养基，培养48 h后添加MTT试剂培养4 h，吸取培养基，加入100 μL DMSO，酶标仪测定570 nm波长各孔A值，绘制细胞活力-顺铂浓度曲线，根据曲线测定比较三组膀胱癌T24细胞的顺铂半数有效浓度(median effective concentration，IC50)。

2 结 果

2.1 膀胱癌组织和癌旁组织GP130表达水平比较

膀胱癌组织GP130阳性表达率为87.50%(28/32)，高于其癌旁组织的46.88%(15/32)，差异有统计学意义(χ2=11.978，P<0.001)。

图1 膀胱癌组织(A)和癌旁组织(B)GP130表达水平(免疫组化，×200)

2.2 三组GP130表达水平比较siRNA-GP130组GP130 mRNA和蛋白水平均低于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-NC组和空白对照组的GP130 mRNA和蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图2。

图2 三组GP130 蛋白表达水平的Western blotting检测结果

表1 三组GP130表达水平比较

2.3 三组细胞增殖、迁移、侵袭和顺铂敏感性比较siRNA-GP130组侵袭细胞数、迁移细胞数、顺铂IC50均低于siRNA-NC组和空白对照组，而其细胞增殖抑制率则均高于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-NC组和空白对照组的侵袭细胞数、迁移细胞数、顺铂IC50、细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 三组细胞增殖、迁移、侵袭和顺铂敏感性比较

3 讨 论

膀胱癌为泌尿系统最常见恶性肿瘤之一，化疗是其不可替代的治疗方法，可在一定程度上延长患者的生存期，改善预后[7-8]。顺铂为膀胱癌一线化疗药物，为细胞毒性化疗药物，顺铂抗癌的主要作用机制为引发DNA损伤和诱导线粒体凋亡，从而促使细胞进入凋亡程序，达到癌症治疗目的[9-10]。化疗药物的重复给药可能导致肿瘤细胞获得性药物抵抗，化疗耐受可导致治疗失败是化疗治疗的一大难题，顺铂抵抗是其治疗后复发率高和预后差的一个重要原因，临床上大约有40%的膀胱癌患者在5年内由于化疗抵抗而出现肿瘤的复发，增加了膀胱癌的治疗难度，膀胱癌化疗的总体预后情况仍较差[11-13]。因此，明确膀胱癌顺铂耐药机制，确定其发生耐药的关键分子，并通过辅助手段提高膀胱癌对顺铂的敏感性，减轻肿瘤细胞获得性顺铂药物抵抗是提高膀胱癌顺铂化疗效果的有效方法。肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移涉及到多种细胞生理学改变，亦是影响膀胱癌等癌症预后的重要因素[14-16]。明确膀胱癌细胞的增殖、侵袭、迁移机制及其关键分子亦可指导其有效治疗。

GP130广泛存在于多种组织细胞内，是与肿瘤炎症免疫微环境、细胞转移、凋亡、增殖等密切相关的蛋白[17-18]。据研究报道，GP130是白细胞介素(Interleukin，IL)-6、IL-11、IL-27等细胞信号分子的下游配体复合物，这些细胞因子可特异性地结合GP130配体复合物的α链，激活下游信号通路从而引发级联反应[19-20]。因此，GP130可能参与膀胱癌的发生发展。本研究检测GP130在膀胱癌组织中的表达，结果显示，膀胱癌组织中GP130阳性表达率高于其癌旁组织，证实了GP130影响膀胱癌的可能性。本研究亦关注GP130与膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和顺铂敏感性的关系，通过体外实验研究，采用脂质体转染法将siRNA-GP130、siRNA-NC转染至膀胱癌T24细胞，并设立不进行转染操作的空白对照，PCR 和 Western blotting 检测结果显示，siRNA-GP130可有效抑制膀胱癌T24细胞的GP130 mRNA和蛋白表达，MMT法检测结果显示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表达后，膀胱癌T24细胞的细胞增殖抑制率出现升高，划痕实验和Transwell侵袭实验检测结果显示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表达后，膀胱癌T24细胞的迁移和侵袭能力降低，而通过含顺铂的培养基培养膀胱癌T24细胞测定的顺铂IC50结果显示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表达后，膀胱癌T24细胞的顺铂IC50降低，证实了GP130参与膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，且影响顺铂获得性抵抗情况。因此，在膀胱癌应用含顺铂的一线化疗方案时，通过GP130抑制剂的应用可能有助于提高其化疗效果并减少顺铂耐药的发生，减少因顺铂耐药导致复发的发生，改善疗效和预后。

综上所述，GP130在膀胱癌中的表达上调并参与膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭，且与顺铂敏感性密切相关，GP130抑制可能成为膀胱癌治疗的有效方法之一，但仍需进一步实验研究和临床试验证实。