麻凯 殷成娟 张振永

上海中医药大学附属普陀医院眼科 200062

青光眼是临床常见的不可逆性致盲眼病，降眼压仍是其主要的治疗方法，可以减少或避免因眼压升高导致的视神经损伤[1-2]。青光眼主要的治疗方法包括应用降眼压药物、激光治疗和手术治疗等，其中降眼压药物在青光眼控制眼压的治疗中扮演重要角色。目前常用的降眼压药物包括拟胆碱药、β肾上腺素能受体阻滞剂、肾上腺素能受体激动剂、碳酸酐酶抑制剂和前列腺素衍生物等，其中前列腺素类药物(prostaglandin analogues，PGA)是目前青光眼降眼压药物中的一线用药[3-4]。PGA可通过上调房水、睫状肌等处基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达，增加细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解，使睫状肌肌间隙增宽，促进房水经葡萄膜-巩膜通道的流出，从而达到降低眼压的目的[5-6]。研究表明，PGA会改变MMPs及MMPs抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)在眼表组织中的表达水平，使MMP-1、MMP-7、MMP-9等的表达水平升高，而TIMP-1、TIMP-2的表达水平显著降低[7]。研究发现，兔眼在点用PGA后2个月，角膜厚度显著变薄；临床研究也发现，长期使用前列腺素类降眼压药物会使患者的角膜厚度明显变薄，其机制可能是基于PGA上调MMPs的表达水平，进而引起角膜基质层胶原蛋白含量减少，导致角膜厚度变薄[8-10]。结膜组织同样是一层主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型等胶原蛋白构成的眼表膜性组织，富含MMPs，但PGA对结膜厚度的影响尚不清楚。本研究拟探讨兔眼局部点用拉坦前列腺素滴眼液后结膜厚度的变化及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组 选取24只12～14周龄清洁级健康无眼疾新西兰大白兔，体质量1.5～2.0 kg，雌雄各半，由上海市松江区松联实验动物厂提供。使用全价颗粒饲料单笼常规饲养，自由饮水和进食，室温26 ℃，湿度为40%～80%。采用随机数表法将实验兔随机分为拉坦前列腺素组、盐酸卡替洛尔组和空白对照组，每组8只，均取左眼作为实验眼。本研究方案经上海中医药大学附属普陀医院实验动物伦理委员会审核批准(批文号：2017-0014)。实验动物的喂养和使用遵循美国视觉与眼科学研究协会制定的科研动物使用规范。

1.1.2主要试剂及仪器 拉坦前列腺素滴眼液(50 mg/ml，比利时辉瑞制药有限公司)；质量分数2%盐酸卡替洛尔滴眼液(中国大冢制药有限公司)；Trizol、RNA逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208)(上海碧云天生物科技有限公司)；Anti-MMP-1兔多克隆抗体(ab137332)、Anti-MMP-3兔多克隆抗体(ab52915)(英国Abcam公司)。CIRRUS HD-光相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)仪(德国蔡司公司)；转膜仪、垂直电泳槽、酶标检测仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；低温高速离心机、梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；荧光显微镜(德国Leica公司)；高精确电子分析天平(德国Sartorious公司)。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组处理 拉坦前列腺素组和盐酸卡替洛尔组分别采用拉坦前列腺素滴眼液和盐酸卡替洛尔滴眼液点实验兔左眼，每天10:00～10:30点眼1次，每次1滴，持续2个月，空白对照组不做任何处理。

1.2.2球结膜厚度测量 分别于点眼前及点眼后2个月，操作者将实验兔固定在OCT镜头前，助手翻起兔颞侧上下眼睑以充分暴露球结膜(左眼1：30～4：30)，另一操作者使用OCT仪测量距角膜缘约0.5 cm处球结膜厚度，每只眼球结膜在相同位置重复测量3次，取平均值，以减少测量误差，尽量减少运动伪影测量的干扰。若因实验兔眼球移动而出现测量误差，则重复测量直至获得满意结果。测量均由同一位有经验的测量人员进行，且球结膜厚度测量均在同一操作室(相同光照、湿度及温度)内进行，比较点眼前后球结膜厚度变化。

1.2.3实验兔球结膜组织标本的制备 点眼后2个月，观察实验兔眼表有无充血、炎症、红肿、糜烂等变化，若有则予以剔除，以免干扰实验结果。采用耳缘静脉注射过量2%戊巴比妥钠法处死实验兔，各组分别取兔左眼球结膜组织，在质量分数0.9%氯化钠溶液中冲洗后立即放入-80 ℃冰箱中保存。使用时将其取出，用眼科剪剪成1 cm×1 cm的组织块并在天平上称质量，用于实时荧光定量PCR和Western blot检测。

1.2.4实时荧光定量PCR法检测各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3 mRNA表达水平 每组取20～30 mg球结膜组织加入EP管中，每个EP管中各加入1 ml Trizol和3颗钢珠，将EP管放在高速研磨机中研磨5 min，频率为65 Hz，静置，抽取上清液，离心半径6 cm，12 000 r/min离心15 min，管底的絮状沉淀即为球结膜组织中总RNA量。根据RNA逆转录试剂盒说明书将球结膜组织中的RNA逆转录为cDNA。设计引物序列(表1)，将cDNA按反应体系配制所需要的PCR缓冲液(冰上进行)，每个样品采用2个复孔的反应体系进行实时荧光定量PCR扩增实验。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，40个循环。在每个循环结束时读取荧光强度。反应结束后，计算机自动分析荧光信号并将其转换为Ct值，以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算每个目的基因的相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。

表1 实时荧光定量PCR引物序列及产物长度Table 1 Primers for real-time fluorescence quantitative PCRand the length of product目的基因引物序列(5’-3’)扩增片段长度(bp)MMP-1正向:GACCAGGTATGAT-GAATATA120反向:AATTTTTCCTGCAGTT-GAACMMP-3正向:CTGAAGCGCTGATGTAC-CCA115反向:AGGGACAGGTTCCATAG-GAβ-actin正向:ATCATGAAGTGCGACGT-GGA113反向:GCGGTGATCTCCTTCTG-CAT 注:MMP:基质金属蛋白酶;β-actin:β肌动蛋白 Note:MMP:matrix metalloproteinase

1.2.5Western blot法检测各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3蛋白表达水平 每组取20～30 mg球结膜组织，按照每10 mg组织大约需要加入100 μl蛋白裂解液的比例配制所需的蛋白裂解液(RIPA裂解液∶ PMSF∶ cocktail=100∶ 1∶ 1)。向EP管中加入灭菌后的钢珠，放在高速研磨机中研磨组织5 min，频率为65 Hz。静置，抽取上清液，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，电泳结束后，在恒流300 mA下转膜2 h，将PVDF膜放入质量分数5% BSA溶液中，于摇床上室温封闭约2 h。弃去BSA溶液，加入5% BSA溶液稀释的Anti-MMP-1兔多克隆抗体(1∶ 1 000)和Anti-MMP-3兔多克隆抗体(1∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜，次日，弃去一抗，加入5% BSA稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶ 1 000)室温孵育1 h。将洗涤后的PVDF膜在凝胶成像仪中显影，采用ImageJ软件进行灰度值扫描，以β-actin作为内参照，目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达灰度值/内参表达灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析。计量资料数据经Shapiro-Wilk检验证实符合正态分布，以mean±SD表示。点眼前后拉坦前列腺素组与盐酸卡替洛尔组实验兔球结膜厚度比较采用重复测量两因素方差分析，点眼后2个月3个组间MMP-1和MMP-3 mRNA及蛋白相对表达量总体比较均采用单因素方差分析，两两比较均采用Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 点眼前后拉坦前列腺素组与盐酸卡替洛尔组实验兔球结膜厚度比较

OCT检测结果显示，与点眼前比较，拉坦前列腺素组点眼后2个月实验兔球结膜全层厚度变薄(图1)。点眼前后拉坦前列腺素组与盐酸卡替洛尔组实验兔球结膜厚度总体比较差异均有统计学意义(F组别=216.72，P<0.01；F时间=118.49，P<0.01)，其中点眼后2个月拉坦前列腺素组实验兔球结膜厚度较点眼前和盐酸卡替洛尔组点眼后2个月均明显变薄，差异均有统计学意义(均P<0.01)(表2)。

图1 OCT测量拉坦前列腺素组实验兔球结膜全层厚度 点眼后2个月兔眼球结膜全层厚度较点眼前明显变薄 A：点眼前 B：点眼后2个月Figure 1 Conjunctival thickness of latanoprost group measured by optical coherence tomography before and after administration The conjunctival thickness was thinner at 2 months after administration A:Before administration B:Two months after administration

表2 拉坦前列腺素组与盐酸卡替洛尔组点眼前后实验兔球结膜厚度比较(mean±SD,μm)Table 2 Comparison of the conjunctival thickness betweenthe carteolol and latanoprost group at different time points(mean±SD,μm)组别眼数不同时间点兔眼眼球结膜厚度点眼前点眼后2个月盐酸卡替洛尔组8184.94±11.85183.31±8.71拉坦前列腺素组8178.88±5.23124.19±11.29ab 注:F组别=216.72,P<0.01;F时间=118.49,P<0.01.与同时间点盐酸卡替洛尔组比较,aP<0.01;与各组内点眼前比较,bP<0.01(重复测量两因素方差分析,Dunnett-t检验) Note:Fgroup=216.72,P<0.01;Ftime=118.49,P<0.01.Compared with the carteolol group at the same time point,aP<0.01;compared with the respective values before administration within each group,bP<0.01 (Repeated measurement two-way ANOVA,Dunnett-t test)

2.2 各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3 mRNA相对表达量比较

实时荧光定量PCR结果显示，点眼后2个月3个组MMP-1和MMP-3 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=38.131、324.037，均P<0.01)，其中拉坦前列腺素组MMP-1和MMP-3 mRNA相对表达量均较空白对照组和盐酸卡替洛尔组明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)(表3)。

表3 各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3 mRNA相对表达量比较(mean±SD)Table 3 Comparison of MMP-1 mRNA and MMP-3 mRNArelative expression levels in conjunctival tissue amongthe three groups (mean±SD)组别样本量MMP-1 mRNA相对表达量MMP-3 mRNA相对表达量空白对照组81.000±0.0081.020±0.408盐酸卡替洛尔组81.130±0.1671.070±0.489拉坦前列腺素组85.550±1.615ab3.380±0.284abF值38.131324.037P值<0.01<0.01 注:与空白对照组比较,aP<0.01;与盐酸卡替洛尔组比较,bP<0.01(单因素方差分析,Dunnett-t检验) MMP:基质金属蛋白酶 Note:Compared with the blank control group,aP<0.01;compared with the carteolol group,bP<0.01 (One-way ANOVA,Dunnett-t test) MMP:matrix metalloproteinase

2.3 各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3蛋白相对表达量比较

Western blot检测结果显示，点眼后2个月拉坦前列腺素组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3蛋白表达条带灰度均强于空白对照组和盐酸卡替洛尔组(图2)。3个组MMP-1和MMP-3蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=26.980、20.586，均P<0.01)，其中拉坦前列腺素组MMP-1和MMP-3蛋白相对表达量均较空白对照组和盐酸卡替洛尔组明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)(表4)。

图2 Western bolt法检测各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3蛋白表达电泳图 拉坦前列腺素组MMP-1和MMP-3蛋白表达条带均强于空白对照组和盐酸卡替洛尔组 A：MMP-1 B：MMP-3 1：拉坦前列腺素组；2：盐酸卡替洛尔组；3：空白对照组 β-actin：β肌动蛋白；MMP：基质金属蛋白酶Figure 2 Electrophoretogram of the expression of MMP-1 and MMP-3 in conjunctival tissue of the three groups detected by Western blot The protein expression bands of MMP-1 and MMP-3 in the latanoprost group were stronger than those in the blank control group and carteolol group 1:latanoprost group；2:carteolol group；3:blank control group MMP:matrix metalloproteinase

表4 各组实验兔球结膜组织中MMP-1和MMP-3蛋白相对表达量比较(mean±SD)Table 4 Comparison of relative expression levels of MMP-1 and MMP-3 protein in conjunctival tissue among the threegroups (mean±SD)组别样本量MMP-1蛋白相对表达量MMP-3蛋白相对表达量空白对照组80.860±0.0300.930±0.023盐酸卡替洛尔组80.880±0.2720.970±0.010拉坦前列腺素组81.040±0.074ab1.000±0.023abF值26.98020.586P值<0.01<0.01 注:与空白对照组比较,aP<0.01;与盐酸卡替洛尔组比较,bP<0.01(单因素方差分析,Dunnett-t检验) MMP:基质金属蛋白酶 Note:Compared with the blank control group,aP<0.01;compared with the carteolol group,bP<0.01 (One-way ANOVA,Dunnett-t test) MMP:matrix metalloproteinase

3 讨论

PGA及其衍生物已成为治疗青光眼，尤其是原发性开角型青光眼的一线用药。PGA具有降眼压作用快、持续时间长的优点，患者依从性较好，且药物对眼表的不良反应较小[11]。研究表明，长期点用PGA滴眼液可使中央角膜厚度明显变薄[8-10,12]。盐酸卡替洛尔滴眼液是临床上常用的降眼压药物之一，其与拉坦前列腺素使用的防腐剂均是苯扎氯铵，使用盐酸卡替洛尔滴眼液作为阳性对照可排除苯扎氯铵对实验结果可能产生的影响。通过在结膜下植入铝箔的方法可以在眼前节OCT图像上区分结膜固有层与下方的Tenon囊膜，从而准确测量结膜全层厚度[13-14]，本研究用同样的方法测量兔球结膜厚度。本研究选择球结膜1:30～4:30为全层厚度测量的部位原因如下：(1)受到上直肌和下直肌的干扰，球结膜厚度测量范围较小；(2)兔下眼睑因眼位使球结膜不易暴露；(3)鼻侧有第三眼睑的干扰。本研究结果显示，拉坦前列腺素滴眼液长期使用可使兔眼球结膜厚度明显变薄，但盐酸卡替洛尔滴眼液的长期使用对兔眼球结膜厚度无明显影响，与本课题组前期临床研究结果一致[15]。

MMPs是一类依赖于锌离子的内肽酶超家族，是一组广泛存在于眼表膜性组织的蛋白水解酶。MMPs可降解ECM的几乎所有成分，包括基质中以及联系于细胞质膜上的各种胶原酶和弹性蛋白酶，是以ECM成分为水解底物的蛋白酶家系，广泛参与各种病理生理过程。MMPs根据底物的特异性可分为以下6种：(1)间质胶原酶(MMP-1、-8、-13)；(2)明胶酶(MMP-2、-9)；(3)间质溶解素(MMP-3、-10、-11)；(4)膜型(MMP-14、-15、-16等)；(5)基质溶解素(MMP-7、-26等)；(6)金属弹性蛋白酶(MMP-12)。TIMPs是一类具有抑制MMPs活性的一组多功能因子家族，目前已经发现TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4通过对MMPs的抑制作用从而影响细胞的增生、生长和分化。MMPs通常以酶原的形式被合成和分泌，其活化可被TIMPs抑制，从而失去水解ECM的能力。MMPs与TIMPs的合成、分泌和活化之间的动态平衡决定了ECM合成和溶解。研究发现长期点用PGA滴眼液使角膜厚度变薄的机制可能是基于PGA使角膜组织中MMP-1、MMP-3等的表达水平升高以及TIMP-1等的表达水平降低，使角膜组织中Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白等的表达水平明显降低，从而使角膜厚度变薄[16]。基于上述研究，本实验分析长期点用拉坦前列腺素滴眼液是否同样会引起兔眼球结膜组织中MMPs表达水平的变化，结果发现拉坦前列腺素组兔眼球结膜组织中MMP-1和MMP-3 mRNA及蛋白表达水平较空白对照组和盐酸卡替洛尔组明显升高，差异均有统计学意义。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)超家族与MMPs的表达密切相关，其中在MAPK家族中与炎症反应密切相关的信号通路分别是细胞外调节蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路和p38 MAPK[17]，这3种信号通路可以通过介导和调控炎性因子发挥不同的作用。此外，MAPK信号通路还可以进一步激活各种靶细胞的核因子-κB、AP-1等转录因子的合成，进而调控MMPs的数量和活性[18]。研究还发现，热休克蛋白可以通过增加炎性因子的表达水平进而激活ERK、JNK信号通路，调控MMP-1和MMP-3的过表达[19]，引起MMPs在转录、翻译水平表达失衡，降解酶合成增加，酶活性增强，导致ECM降解。PGA作用于眼表后是否通过上述途径使球结膜组织中MMP-1、MMP-3的表达水平升高，从而引起胶原纤维溶解，使球结膜变薄，仍需要进一步研究，以期明确PGA长期作用于兔眼表后使结膜厚度变薄的机制。

对于药物难以有效控制眼压的青光眼患者仍需要进行手术治疗，滤过手术仍是目前临床上常用的治疗青光眼的手术方式，但瘢痕形成和ECM成纤维细胞增生阻塞滤过道是青光眼滤过手术失败的主要原因，抑制滤过手术后球结膜瘢痕的形成和刺激ECM的降解以维持滤过泡的形态及滤过道的通畅对于青光眼滤过手术后房水的重吸收具有重要意义[20]。MMPs可广泛降解多种胶原纤维和弹力纤维，对滤过手术后结膜瘢痕形成和ECM堆积起到一定的抑制作用[21]。对于青光眼患者，滤过手术后适量点用PGA是否有利于维持滤过泡的形态及滤过道的通畅，从而利于滤过手术后房水的引流，值得进一步研究。结膜淋巴管广泛分布于球结膜组织中，对青光眼滤过手术后房水的重吸收起决定性作用[22-23]。结合本实验研究结果，变薄的球结膜组织对滤过手术将会产生何种影响，球结膜变薄后结膜淋巴管的密度是否降低并因此抵消结膜变薄、理论上增加滤过效应，以及PGA对结膜淋巴管的影响还需要进一步研究。

本研究结果显示，前列腺素类降眼压药物的长期使用可使实验兔球结膜厚度变薄，其变薄的机制可能与球结膜组织中MMP-1和MMP-3的表达水平升高有关，这将为青光眼的临床治疗和基础研究提供一定的参考。但本研究并未对球结膜组织中其他相关MMPs进行统一检测，不排除前列腺素类滴眼液作用于结膜后对其他MMPs表达水平产生影响，其具体机制仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突