李雯 曹兴 叶长华

中南大学爱尔眼科学院 长沙爱尔眼科医院，长沙 410004

李雯现在湖南省儿童医院眼科，长沙 410007

青光眼是全球主要的不可逆性致盲眼病，以进行性视神经损害和视野缺损为共同特征[1-2]。尽管当前对遗传、神经营养、筛板处改变、炎症损害等青光眼发病机制方面的研究越来越多，但高眼压仍是青光眼关键的危险因素，对青光眼的发生和发展至关重要[3]。高眼压导致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡和视神经损伤，其作用机制复杂，尚未完全阐明。血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)为视网膜的免疫赦免提供了解剖学基础，对视网膜微环境的稳态调节及正常视功能维持具有重要作用。因此，高眼压是否通过破坏BRB改变视网膜微环境，从而对视网膜造成损伤值得探讨。目前国内外关于急性高眼压对BRB破坏的研究主要集中在血-视网膜内屏障(inner blood-retinal barrier，iBRB)，而其对血-视网膜外屏障(outer blood-retinal barrier，oBRB)破坏的研究报道较少见。本实验拟从oBRB破坏的角度探讨高眼压损伤视网膜的病理机制，为青光眼发病机制及治疗手段研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组 选取SPF级雄性C57BL/6J小鼠57只，体质量24～27 g，购自湖南斯莱克景达公司，均在12 h明暗循环、室温22～25 ℃、相对湿度为(50±5)℃的环境中饲养。采用随机数表法将小鼠随机分为对照组和高眼压组，其中对照组25只，高眼压组32只，剔除建模失败或建模不佳的小鼠后，每组最终纳入20只，均以左眼为实验眼。本研究按照视觉与眼科研究协会指南进行，经长沙爱尔眼科医院伦理委员会审核批准(批文号：2018-KYPJ005)。

1.1.2主要试剂及仪器 质量分数1%托吡卡胺滴眼液、盐酸奥布卡因滴眼液(日本参天株式会社)；FAS固定液(武汉赛维尔生物公司)；OCT包埋剂(美国Sakura Finetek公司)；兔抗小鼠紧密连接蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)抗体(ab96587)、山羊抗兔IgG Cy5(ab97077)(英国Abcam公司)；DAPI(美国Vector公司)。TonoLab眼压计(芬兰Icare Finland Oy公司)；动物OCT眼科成像仪Micron Ⅳ(美国Phoenix Research Labs公司)；冷冻切片机(美国Thermo公司)；立体显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1急性高眼压诱导视网膜缺血-再灌注损伤小鼠模型的建立 采用腹腔内注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉小鼠，1%托吡卡胺滴眼液点眼扩瞳，5 min后采用质量分数0.5%盐酸奥布卡因滴眼液点眼进行局部麻醉。将连接无菌质量分数0.9%氯化钠溶液的30G输液针头从小鼠角巩膜缘偏角膜侧约1 mm处穿刺至左眼前房，打开输液开关并将0.9%氯化钠溶液缓慢升高至术眼上方135 cm处，使眼压维持在90～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，虹膜和视网膜变白证实缺血状态达成。视网膜缺血过程持续45 min，随后取出针头恢复视网膜血流的再灌注。对照组采用30G针头插管连接无菌氯化钠溶液仅作前房穿刺。眼压由同一操作者持TonoLab眼压计测量。术后采用妥布霉素软膏涂于眼表和结膜囊预防眼部感染。剔除术中出现虹膜出血或术后出现医源性白内障或眼前节炎症的小鼠。

1.2.2动物OCT检测小鼠视网膜厚度变化 建模后2 d，采用腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，托吡卡胺滴眼液点眼扩瞳，奥布卡因滴眼液点眼行表面麻醉；采用动物OCT眼科成像仪Micron Ⅳ扫描小鼠视网膜，移动三维试验台使扫描光束经角膜垂直透射至眼底，调节至显示屏出现清晰的视盘及大血管图像，视盘位于图像中心区域。采用环形扫描模式采集图像，收集以视盘为中心的视网膜圆环图像，采用Insight软件(美国Phoenix Research Labs公司)标记视网膜全层，并通过软件导出厚度差表格计算视网膜全层厚度。

1.2.3免疫荧光染色法观察视网膜ZO-1蛋白变化 建模后2 d，每组任意选取5只小鼠，颈椎脱臼法处死后摘取左眼眼球制备视网膜冰冻切片，采用体积分数0.25% Triton X-100室温下封闭15 min，质量分数3%牛血清白蛋白室温下通透60 min。切片样本加入兔抗小鼠ZO-1(1∶ 150)抗体后于4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤后室温下用相应二抗(cy5，1∶ 300)孵育1 h，DAPI(1∶ 2 000)染色5 min。荧光显微镜下观察并拍照，高亮的红色荧光代表阳性染色。

1.2.4胰蛋白酶消化法检测视网膜毛细血管退化情况 建模后7 d，每组选取5只小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，摘出眼球，将视网膜视杯在室温下立即浸入质量分数10%中性甲醛中固定24 h，去离子水冲洗过夜。将视网膜在包含弹性蛋白酶(40 μg/ml)、PBS(100 mmol/L)、氯化钠溶液(150 mmol/L)和乙二胺四乙酸的混合液(pH=6.5)中37 ℃孵育2 h。室温下转移至Tris-HCl(100 mmol/L，pH=8.5)中孵育1 h。用细毛刷去除视网膜上的非血管组织，并在载玻片上干燥10 min。采用过碘酸希夫染色和苏木精-伊红染色视网膜血管。将沿血管长轴未发现细胞核的血管定义为退化的毛细血管。染色拍照后以视盘为中心划分区域，分区域计数后相加得到整个视网膜平铺图中退化毛细血管数量。

1.2.5苏木精-伊红染色法观察视网膜炎性细胞浸润情况 建模后2 d，每组选取5只小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，取出眼球，浸泡于FAS固定液中4 h，蔗糖梯度脱水，OCT包埋，沿视网膜前后径方向制成8～10 μm厚的冰冻切片。取含视神经在内的切片进行常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析和制图。计量资料的数据经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以mean±SD表示。2个组退化的毛细血管数量和视网膜全层厚度差异比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2个组小鼠视网膜厚度及形态比较

对照组小鼠视网膜颜色均一，视盘呈黄色，视网膜血管以视盘为中心呈放射状走行；高眼压组小鼠视网膜可见大片区域变灰，视网膜水肿程度较重，伴明显渗出。对照组OCT图像显示视网膜各层结构排列均一、整齐；高眼压组小鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)层结构紊乱，伴明显渗出，局部神经上皮层脱离、隆起。高眼压组小鼠视网膜全层厚度为(235.8±5.3)μm，较对照组的(213.3±3.9)μm明显增厚，差异有统计学意义(t=3.427，P=0.009)(图1)。

图1 急性高眼压诱导视网膜缺血-再灌注损伤后小鼠视网膜全层厚度及形态变化 A：对照组眼底照相示视网膜血管走行正常 B：对照组OCT图像示视网膜各层结构排列整齐 C：高眼压组眼底照相可见大片视网膜水肿 D：高眼压组OCT图像示视网膜局部隆起(白色箭头) E：2个组视网膜全层厚度比较 与对照组比较，aP<0.01(独立样本t检验，n=5) RNFL：视网膜神经纤维层；GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；ONL：外核层Figure 1 Morphology and full thickness of mouse retina after ischemia-reperfusion injury following acute intraocular hypertension A：Normal vessels were observed in fundus image of normal mice B：Different layers of retina were in regular arrangement in OCT image of normal mice C：Retinal edema was seen in fundus image of high-intraocular pressure mice D：Local eminence was observed in the high-intraocular pressure group in OCT image of high-intraocular pressure mice (white arrow) E：Comparison of retinal full thickness between the two groups Compared with the control group，aP<0.01 (Independent-samples t test，n=5) RNFL：retinal nerve fiber layer；GCL：ganglion cell layer；IPL：inner plexiform layer；INL：inner nuclear layer；ONL：outer nuclear layer

2.2 2个组小鼠视网膜组织中ZO-1分布变化

ZO-1免疫荧光染色结果显示，小鼠RPE层中ZO-1主要定位在细胞膜上，少部分在细胞质中，细胞以六边形为主。高眼压组ZO-1出现明显内化，细胞膜上ZO-1减少，细胞质中ZO-1增多，整体分布紊乱(图2)。

图2 急性高眼压诱导视网膜缺血-再灌注损伤后2 d各组小鼠视网膜组织中ZO-1分布变化(DAPI ×200，标尺=40 μm) 对照组小鼠RPE层中ZO-1主要分布在细胞膜上，高眼压组ZO-1出现明显内化，分布紊乱 ZO：紧密连接蛋白；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚Figure 2 Distribution of ZO-1 protein in mouse retina at two days after ischemia-reperfusion injury following acute intraocular hypertension by immunofluorescence staining (DAPI ×200，bar=40 μm) ZO-1 in the RPE layer was distributed in the cell membrane in the control group，and was irregular in the high-intraocular pressure group ZO:zonula occludens;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole

2.3 2个组小鼠视网膜毛细血管退化比较

建模后7 d，高眼压组小鼠可见视网膜中退化的毛细血管数量明显增多，其血管管径变窄呈细线状，对照组小鼠视网膜中退化的毛细血管少。高眼压组退化的毛细血管数量为(201.0±13.2)根，明显多于对照组的(11.2±1.7)根，差异有统计意义(t=14.280，P<0.01)(图3)。

图3 急性高眼压诱导视网膜缺血-再灌注损伤后7 d各组小鼠视网膜毛细血管退化情况 A：对照组小鼠视网膜血管染色可见视网膜中退化毛细血管较少(PAS+HE ×200，标尺=40 μm) B：高眼压组小鼠视网膜血管染色可见视网膜退化毛细血管数量明显增多(红色箭头)(PAS+HE ×200，标尺=40 μm) C：2个组小鼠视网膜中退化毛细血管数量比较 与对照组比较，aP<0.01(独立样本t检验，n=5)Figure 3 Degeneration of mouse retinal capillaries at seven days after ischemia-reperfusion injury following acute intraocular hypertension A：Staining of retinal blood vessels in the control group (PAS+HE ×200，bar=40 μm) Few degenerated retinal capillaries were observed B：Staining of retinal blood vessels in the high-intraocular pressure group (PAS+HE ×200，bar=40 μm) The number of degenerated retinal capillaries was significantly increased (red arrows) C：Comparison of the number of degraded capillaries in the whole retina between the two groups Compared with the control group，aP<0.01 (Independent-samples t test，n=5)

2.4 2个组小鼠视网膜中炎性细胞浸润情况比较

苏木精-伊红染色结果显示，高眼压组小鼠视网膜中可见炎性细胞浸润，炎性细胞的细胞核为多叶核，主要是嗜中性粒细胞，浸润的炎性细胞主要位于内界膜下(图4)。

3 讨论

本研究中采用前房灌注升高眼压的方法建立小鼠缺血-再灌注损伤模型，其是研究青光眼发病机制及药物疗效的成熟模型[4-6]。研究结果表明，视网膜缺血-再灌注损伤后oBRB遭到破坏，引起炎性细胞浸润及视网膜水肿、变形，视网膜血管退化。

视网膜特有的BRB包括视网膜毛细血管管壁内皮细胞形成的iBRB以及RPE细胞构成的oBRB，是视网膜免疫赦免的解剖学基础，为维持正常的视功能提供稳定的微环境[7-8]。BRB遭到破坏可引起外周免疫细胞浸润、视网膜形态和功能改变以及神经元损伤等病理变化，进而损害视网膜功能。

高眼压是青光眼发病机制中关键的危险因素，控制眼压是目前临床上手术和药物治疗的主要目标。高眼压引起RGCs凋亡和视网膜神经纤维损伤的作用机制复杂。目前国内外关于视网膜缺血-再灌注损伤对BRB影响的研究主要集中在iBRB的破坏，研究者们从心脏灌注伊文思蓝后取视网膜铺片进行染色观察，或者计算视网膜中伊文思蓝染料增加的质量或荧光强度，以此定性或定量分析视网膜毛细血管的渗漏情况，从而判断iBRB破坏程度[9-11]，而关于视网膜缺血-再灌注损伤对oBRB作用的报道较少见。oBRB在视网膜中扮演着重要的角色，其将脉络膜与视网膜分隔[12]。RPE中的ZO-1构成了oBRB，ZO-1对维持oBRB的功能非常重要。本研究发现在急性高眼压诱导的视网膜缺血-再灌注损伤后，分布在小鼠RPE细胞膜上的ZO-1出现内化和紊乱，证明了视网膜缺血-再灌注损伤会破坏RPE间的紧密连接，从而破坏oBRB的完整性。这种急性高眼压引起视网膜缺血-再灌注损伤导致ZO-1表达的内化和紊乱与光损伤、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β刺激后RPE细胞上ZO-1的表达改变类似[13-14]。

本研究中苏木精-伊红染色结果显示，高眼压组小鼠视网膜各层中均可见粒细胞浸润，以分叶核的中性粒细胞为主。这种来自外周血液循环中的粒细胞在视网膜的出现与oBRB和iBRB的破坏有关，意味着视网膜的免疫赦免状态被打破。外周血中的白细胞穿过BRB的具体机制较复杂，研究发现这种迁移需要白细胞本身的改变、BRB的破坏及视网膜周围的微环境发生改变[7]。本研究发现，视网膜缺血-再灌注损伤后7 d视网膜毛细血管出现退行性变，萎缩的毛细血管明显增多，意味着BRB被破坏后引起的视网膜微环境改变对视网膜中的毛细血管造成明显损害。

RPE细胞构成的oBRB将神经视网膜与有孔的脉络膜毛细血管分开，保证生理状态下视网膜相对脱水、透明的状态。oBRB破坏往往伴随着视网膜形态结构的改变，并引起视网膜下液积聚。本研究采用OCT法检测高眼压损伤后的视网膜形态及厚度，相较苏木精-伊红染色检测无创且更准确，避免了在制片和染色过程中可能带来的误差，同时可以观察到小鼠的眼底。本研究中动物OCT检查结果显示，高眼压组小鼠RPE层结构紊乱伴有明显渗出，神经上皮层局部脱离、隆起，眼底照相可见大片区域变灰，视网膜水肿程度较重。此外，建模后2 d高眼压组视网膜较对照组有所增厚，这与oBRB遭到破坏后视网膜水肿的现象相符。

综上所述，本实验通过建立小鼠急性高眼压模型引起视网膜缺血-再灌注损伤，结果发现损伤后oBRB的完整性遭到破坏，引起外周循环中粒细胞的浸润及视网膜水肿，甚至脱离，视网膜毛细血管出现萎缩。本研究结果为青光眼发病机制的研究及治疗提供了新的思路，值得进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明李雯：设计实验，实施研究，采集并分析数据，对文稿审阅修改；曹兴：实施研究，分析数据，起草文稿；叶长华：设计实验，分析数据，对文稿审阅修改，指导实验进展，提供实验经费