蒲首丞，胡美娟，陈梦露，郑 治，尹新忠

（1. 浙江华仕达茶业股份有限公司，浙江 武义 321200；2. 浙江华茗园茶业有限公司，浙江 永康 321300；3. 浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江金华 321000；4. 浙江省永康市食品与药品检测中心，浙江永康 321300）

0 引言

近年来，抹茶作为一种健康天然饮品，受到人们的欢迎，由于覆盖栽培及特殊加工方法，抹茶极大地保持了绿茶鲜叶原有的天然色泽及营养保健功效成分。抹茶保留了茶叶中的100 多种成分，主要为茶多糖、茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸、叶绿素、蛋白质、芳香物质、纤维素，还有大量的维生素和矿物质，其中茶氨酸和叶绿素含量都比较高，这些生物活性成分使得抹茶具有改善血液流动、改善心血管疾病、缓解压力、安眠功效、降血脂、降血糖等作用[1-2]。茶氨酸和茶多酚是抹茶主要成分，茶氨酸（N - 乙基γ - 谷氨酰胺） 是一种酰胺类化合物，天然存在的茶氨酸均为L 型，是茶叶中特有非蛋白类氨基酸，具有稳定的化学性质及非常高水溶性，占茶叶中游离茶氨酸的一半作用，可以减弱茶的苦涩味，增加茶鲜美的味道，可作为一种食品添加剂使用[2-4]。许多科学研究表明，茶氨酸具有增强人体免疫力、降低血压、抑制癌细胞生长、保护神经细胞、抑制神经元的凋亡、松弛神经紧张、安神作用等作用[4-7]。目前，关于茶多酚研究比较多，特别是儿茶素类活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗高血压等作用[8]。

基于UPLC-MS 测定抹茶中主要6 种特征性成分，主要包括茶氨酸和儿茶素类成分，分析2020 年春茶同一茶园不同时间段抹茶主要成分变化，通过聚类分析不同时间段的样品，以期为抹茶质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

抹茶，2020 年春茶（鸠坑）。

1.1.2 试剂

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯；水；标准品：茶氨酸（L-The）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG），上海安谱试验科技股份有限公司提供；咖啡碱（CAF），中国计量科学研究院提供。

1.1.3 仪器设备

JYL-C020E 型多功能料理机，九阳股份有限公司产品；FA2004 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；TG16-WS 型台式高速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司产品；HH-600 型数显恒温循环水箱，常州智博瑞仪器制造有限公司产品；1290 Infinity 型超高效液相色谱仪、色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C18型，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、保护柱（ZORBAX Eclipse Plus C18型，2.1mm×50 mm，1.8μm），安捷伦公司产品；4500 型三重四极杆质谱TRIPLE QUAD 4500，AB Sciex 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品制备

标液：精确称取标准物质各10.0 mg，分别用70%甲醇水溶解后定容至10 mL 棕色容量瓶中，得质量浓度为1 000 μg/mL 储备母液，不同质量浓度混合标准品溶液用储备母液稀释配制。

混和标准品溶液见表1。

表1 混和标准品溶液

1.2.2 供试品制备

供试液：称取0.2 g 样品，加入在70 ℃预热过的70%甲醇溶液50 mL，混于100 mL 锥形瓶中，于70 ℃水浴中浸提20 min（5 min 搅拌1 次），冷却后转移到100 mL 容量瓶中，用70%甲醇水定容至刻度，摇匀。移液管移取1 mL 上清液于100 mL 容量瓶中，用70%甲醇水定容至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.3 UPLC- MS 分析条件

（1） 色谱条件。流动相：乙腈（流动相A）、0.1%甲酸水溶液（流动相B），流速0.2 mL/min，进样量1 μL，柱温40 ℃，运行时间15 min。

流动相梯度见表2。

表2 流动相梯度

（2） 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI），扫描模式：正离子模式，扫描方式：多反应离子监测（MRM），离子化电压5 500 V，加热温度450 ℃，喷雾气GS1 50 psi，辅助加热气GS2 50 psi，碰撞气CAD 8，气帘气CUR35 psi，MRM离子对信息。

MRM离子对信息见表3。

表3 MRM 离子对信息

1.2.4 方法学考查

（1） 线性关系考查。精密吸取不同质量浓度混合标准照品溶液分析，1 μL 进样，测其峰面积，以标准溶液的进样含量为横坐标，以峰面积为纵坐标作图，得到线性回归方程，求相关系数R。

（2） 精密度试验。精密吸取配制的对照品溶液1 μL 进样，依上述色谱条件测定，重复进样6 次，测定计算目标峰面积，计算RSD 值。

（3） 稳定性试验。取制备的供试样品溶液，于0，2，4，6，8，10 h 进样测定，按1.2.3 色谱分析条件，进样量为1 μL，测定目标峰面积，计算RSD 值。

（4） 重复性试验。取样品按1.2.2 方法制备供试品溶液6 份，按1.2.3 色谱分析条件，进样量为1 μL，测定峰面积，计算RSD 值。

（5） 加样回收试验。精密称取已知含量的茶样品3 份，分别精密加入一定量高中低对照品，按

1.2.2 供试品溶液制备方法制备样品溶液，依上述色谱条件测定含量。

1.2.5 样品含量测定

取不同时间段采集生产加工抹茶，以1.2.2 进行前处理，在按1.2.3 色谱分析条件进行测定，检测不同抹茶样品中的茶氨酸、儿茶素类和咖啡因含量。

1.2.6 聚类分析

以6 批样品的7 个主要特征成分含量为指标，运用SPSS19 统计分析软件，进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考查

2.1.1 线性关系考查

混合标准品UPLC-MS 色谱图见图1，线性回归方程和相关系数见表4。

图1 混合标准品UPLC-MS 色谱图

表4 线性回归方程和相关系数

图1 为混合标准品UPLC-MS 色谱图，表4 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG 和ECG 的色谱保留时间标准曲线回归方程、相关系数和线性范围。结果表明，抹茶中7 种化合物灵敏度较高，在给定的质量浓度范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度试验

精密度、稳定性和重复性试验相对标准偏差RSD 值见表5。

表5 精密度、稳定性和重复性试验相对标准偏差RSD 值/%

表5 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG和ECG 的精密度试验RSD 值，分别为2.83%，4.42%，1.67%，2.03%，0.92%，3.66%和1.96%，结果表明试验仪器要具有较好的精密度。

2.1.3 稳定性试验

取制备的供试样品溶液于0，2，4，6，8，10 h进样测定，表5 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG 和ECG 的稳定性试验RSD 值，分别为5.74%，3.75%，4.36%，3.09%，2.58%，7.44%和3.39%，供试品溶液中EGCG 的稳定性没有其他成分高。

2.1.4 重复性试验

表5 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG和ECG 的供试品重复性试验RSD 值，分别为1.91%，2.24%，4.16%，6.55%，1.51%，1.98%和1.34%，表明茶样具有较好重复性。

2.1.5 加标样回收试验

添加1 mL 选择已知质量分数的样品作为本底样品，在本底样品中准确加入低、中、高3 个质量浓度的混标，然后进行分析。

7 种多酚物质的加标样回收率分析见表6。

表6 7 种多酚物质的加标样回收率分析

2.2 不同时间样品含量测定

样品含量分析见表7。

表7 样品含量分析/ mg·g-1

采用该方法测定的浙江武义同一个茶园不同时期生产抹茶样品7 种特征化合物，其中茶氨酸变化最明显，下降最多，儿茶素类呈现缓慢降低，具体结果见表7。前3 d，茶叶中茶氨酸的含量较高为24 mg/g，在5 d 后茶氨酸含量降低50%左右，为13 mg/g，与感官审评结果相符合，前3 d 抹茶滋味清鲜、略带海苔味，后几天茶样微涩，也与其他科研人员关于茶氨酸对抹茶品质呈正相关的研究一致[9]。

2.3 聚类分析

以抹茶主要特征成分L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG 和ECG 为指标，采用组间联接法、平方Euclidean 距离度量标准进行系统聚类分析。

聚类分析见图2。

图2 聚类分析

当距离大于15 时，样品可分为2 类，其中day1和day3 抹茶为一类，day5，day7，day9 和day11 聚为一类；当距离在10 左右时，可将6 个时间短样本很好的分为3 类，其中day1 和day3 抹茶仍为一类，day5，day7，day9 聚为一类；day11 单独聚为一类。由此可见，不同生长时间段抹茶的主要特征生化成分随时间在不停变化，其中茶氨酸变化最大，通过统计聚类分析可以很好地区分不同时间段抹茶，对抹茶等级划分具有较好指导意义。

3 结论

建立了UPLC-MS 同时测定抹茶中7 特征性化合物的分析方法，具有灵敏度高、准确稳定、方便快捷等特点，适合于茶叶中茶氨酸儿茶素和咖啡碱类化合物的快速测定。