方振宇，任 娟，全炳荣，金花子

（延边大学农学院，吉林延吉 133000）

细胞凋亡（Apoptosis）是指机体为了维持自身内环境稳定，由基因控制细胞发生自主且有序的死亡过程[1]。与细胞坏死不同，细胞凋亡是机体为了更好地适应新的生存环境所进行的死亡过程。细胞凋亡主要的形态变化为细胞浓缩，染色体DNA 被以核小体为单位切成梯状片段，细胞缩小，形成细胞凋亡小体，凋亡小体再通过细胞膜表面以出芽的方式脱落，最终被附近的吞噬细胞所吞噬[2]。

卵巢作为雌性动物重要的生殖腺，其主要功能是生产卵细胞以及分泌雌激素。在雌性动物的生殖周期中，99%以上的卵泡都会发生卵泡闭锁从而退化，而仅有不到1%的卵泡能够发育至成熟[3]，绝大部分的卵泡会发生闭锁，而卵泡闭锁的实质就是细胞凋亡[4-5]。本文综述了细胞凋亡的过程与调控机制，并对影响啮齿类动物卵泡颗粒细胞凋亡的因素进行分析，为揭示细胞凋亡机制的理论奠定基础，进而有助于畜牧业动物快速扩繁。

1 细胞凋亡的过程与调控机制

1885 年Flemming[6]研究卵巢卵泡细胞时发现了一种与细胞坏死不同的细胞死亡现象，并在1887 年将这种细胞死亡现象称为染色质溶解死亡。1972 年澳大利亚生物学家Kerr 等[7]在电镜下观察到有别于细胞膨胀、崩溃等细胞坏死的典型性状，而是以细胞核浓缩、细胞内DNA 断裂等现象为特征的细胞死亡，其推测这种细胞坏死的死亡机理肯定和普通的细胞坏死不同，有可能是机体自身基因控制的一种死亡，因此将这种死亡现象称为“细胞凋亡”。

细胞凋亡过程可分为4 个阶段：凋亡信号转导、激活凋亡基因、执行凋亡、清除凋亡细胞。其机理是凋亡诱导因素与细胞受体经生化作用后形成死亡信号并激活凋亡相关基因，半胱氨酸蛋白酶（Caspase）进行活化反应并激活核内部的核酸内切酶及Caspase-3，降解细胞内的蛋白质，致使细胞死亡，最后凋亡的细胞由吞噬细胞分解[8]。造成细胞凋亡的相关基因主要有Caspase家族、Bcl-2家族及肿瘤坏死因子受体超家族等，其中Bcl-2家族与生殖细胞凋亡最为密切。

迄今为止，被科学所证实的细胞凋亡信号通路共有4 种[9]：凋亡受体信号通路、线粒体通路、内质网信号通路、Caspase 非依赖的细胞凋亡途径。

1）凋亡受体信号通路。凋亡受体是一类跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族的一员，常见的受体有Fas、TNFRI、DR3，其对应的配体为FasL、TNF、Apo-3。细胞外的凋亡配体与细胞膜上的凋亡受体特异性结合，并进入细胞内部，Caspase-8、Caspase-10 等被细胞内的天冬氨酸特异性刺激后产生一系列的生化反应。死亡受体聚合之后，导致接头蛋白的结合并激活Caspase 的级联反应。

2）线粒体通路。线粒体不仅是细胞能量的代谢中心，还是细胞内源性凋亡信号诱导的细胞凋亡中心，所以也将线粒体通路称为内源性凋亡。线粒体在细胞功能强的区域广泛分布。线粒体造成的细胞凋亡包括3 种机制：①电子传递、ATP 产生的破坏及氧化磷酸化；②激活并释放Caspase 家族蛋白；③最为直接的方法是改变细胞氧化还原的能力。在凋亡因素刺激下线粒体跨膜电位消失，导致膜的通透性发生变化，细胞色素C（Cyt-c）释放并与dATP、活化因子-1（Apaf-1）、pro-Caspase-9 结合形成凋亡小体，激活Caspase-9，最终造成细胞凋亡[10]。研究证明[11]虽然细胞的凋亡途径有多种，但外源性（凋亡受体）途径和内源性（线粒体）途径是主要的凋亡过程，且均由Caspase 家族介导。

3）内质网信号通路。内质网通路的发现要比前面两者稍晚一些，它和细胞凋亡之间的关系主要在于：①对钙离子的作用；②内质网的应激反应；③内质网上的Bcl-2基因家族参与细胞凋亡。内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网Ca2+平衡破坏或者过度积累造成位于内质网膜的Caspase-12 的表达，进而激活Caspase-9，自噬相关蛋白被切断，最终导致细胞凋亡（图1）。

图1 细胞凋亡通路图[13]

4）Caspase 非依赖的细胞凋亡途径。通常情况下，凋亡诱导因子（AIF）存在于线粒体内膜，受到凋亡信号刺激时，AIF从线粒体转移到细胞质内，然后进入细胞核中，引起核内DNA 的聚集，并最终导致大量DNA片段的断裂，造成细胞凋亡[12]。

2 影响啮齿动物卵泡颗粒细胞凋亡的因素

卵泡颗粒细胞凋亡的主要原因是卵泡闭锁。啮齿动物卵泡颗粒细胞凋亡的机制十分复杂，造成的原因也很多，主要分为内在因素和外在因素。

2.1 内在因素 激素、细胞因子等内在因素是影响卵泡颗粒细胞凋亡最主要的因素，通过促进或抑制凋亡因子对其进行调控。

2.1.1 激素 激素以对细胞特有的方式在其存在或消失的状态下引起细胞凋亡，并通过对细胞发生免疫反应的程度进行调节，以维持机体平衡[14]。大部分激素对颗粒细胞的凋亡发挥抑制作用。体内研究表明，小鼠中促卵泡激素（FSH）表达可以在mRNA 水平上抑制3-硝基丙酸（3-NP）诱导的细胞凋亡和P53 上调的凋亡调控因子（PUMA）的表达；在体外实验中发现，FSH 可以在mRNA 水平上抑制过氧化氢（H2O2）诱导的细胞凋亡和PUMA的表达，证明FSH 能够抑制颗粒细胞的凋亡[15]。这与牛生长激素在小鼠卵巢细胞当中过表达的结果相似[16]，相比于正常小鼠其卵泡凋亡率显著降低16%，而排卵前的健康卵泡也比正常小鼠显著高3.1%，表明牛生长激素能够减少卵泡的闭锁率，进而增加排卵数。但并不是所有的激素对颗粒细胞凋亡具有抑制作用，Danilovich 等[17]对脑切除并经过雌激素处理的大鼠进行GnRH 类似物（Leuprolide Acetate，LA）注射，之后通过原位末端转移酶标记技术对表现出DNA 片段化的细胞核进行免疫细胞化学定位，结果表明在所研究的所有时间（注射LA 的1、2、4 或7 d），经过LA 处理过的小鼠其卵泡颗粒细胞凋亡数量增加。总之，大部分激素通过抑制细胞凋亡而对卵泡颗粒细胞的生长起促进作用。

2.1.2 细胞因子 细胞因子作为细胞外的环境因素影响卵泡颗粒细胞的凋亡，也可分成抑制凋亡和促进凋亡两类[18]。胰岛素样生长因子-I（IGF-I）作为抑制细胞凋亡的细胞因子对卵泡影响较深，Chun 等[19]收集大鼠排卵前卵泡，进行有无类IGF-I 体外对照培养，培养24 h 后发现对照组凋亡DNA 片段增加，而IGF-1 组能够自发地抑制颗粒细胞的凋亡作用。而转化生长因子（TGF）在卵泡中发挥的作用与IGF-I 有所不同，体外实验证明，TGF-α和TGF-β1只存在其中1 种因子时对颗粒细胞没有影响，但它们同时存在的情况下，会协同导致大鼠颗粒细胞的凋亡[20]。此外，还有其他细胞因子对颗粒细胞凋亡起着促进作用，如温鑫等[21]发现Zhangfei 因子在小鼠卵泡发育及闭锁过程中均有表达而且参与调控卵泡的发育及闭锁，证明Zhangfei 不仅能促进内质网的应激，还能够抑制ERK1/2 的磷酸化，促进卵巢细胞的凋亡。Choi 等[22]研究表明Krüppel 样因子4（Klf4）过表达会通过下调Bcl-2 基因的水平增加排卵前大鼠颗粒细胞的敏感性，从而使颗粒细胞凋亡的比例升高。

凋亡是一种通过细胞内促凋亡基因和抗凋亡基因的共同调控，激活凋亡基因，最终诱导细胞凋亡的过程。例如Bcl-2家族基因，与细胞凋亡最密切相关的基因之一，在凋亡中起着重要作用。屈丽华[23]通过对大鼠不同发育时期卵细胞生长研究发现，Bcl-2/Bax基因对其卵泡细胞的发育和凋亡有重要的调节作用，且卵泡闭锁及卵泡中不同细胞的凋亡机制与调控方式随卵巢不同发育时期、卵泡不同发育阶段而异。而汝文文[24]也通过实验证明了在大鼠卵巢颗粒细胞凋亡中Bcl-2/Bax基因的比例越大细胞就趋于存活，反之则更趋于凋亡。除Bcl-2基因家族外，Caspase 家族也在细胞凋亡中发挥至关重要的作用。多囊卵巢综合征（PCOS）的大鼠卵巢组织中Caspase-3 的mRNA 水平比正常大鼠高，是因在其发病过程中NF-κB 通过正向诱导Caspase-3 的表达，诱导颗粒细胞凋亡[25]。

2.2 外在因素 除内在因素外，环境污染物、辐射等一些外在因素也影响啮齿动物卵巢功能障碍，最终损害生殖系统[26]。

2.2.1 环境污染物 环境中许多有害物质会通过不同的凋亡途径诱导颗粒细胞的凋亡。盛菲等[27]使用不同浓度的多环芳烃（PAHs）对小鼠卵巢进行体外培养，结果显示随着浓度增加卵泡数量减少，随后通过免疫组化法证明PAHs 可通过干预Caspase-3、Caspase-9 和Bcl-2/Bax基因表达来促进卵泡凋亡，进而影响卵泡功能。Loretta 等[28]对大鼠进行4-乙烯基环己烯二环氧化物（VCD）80 mg/kg·d 的腹腔注射，并在随后的时间点评估动物的生殖性能时，发现随着时间的推移，VCD 组中的周期性被破坏，导致其诱导大鼠卵泡破坏与卵巢早衰。同样，将小鼠卵巢暴露于全氟丁烷磺酸盐（PFBS）（≥200 mg/kg·d）中，PFBS 通过降低甲状腺激素水平致使卵泡颗粒细胞和卵丘细胞Akt-mTOR 信号下调，最终导致卵泡发育和卵巢激素生物合成障碍[29]。由此得出，环境中存在着一些有毒物质影响卵泡颗粒细胞的正常生长。

2.2.2 植物提取物 植物中的一些物质含有毒素，会直接影响包括卵巢在内的生殖系统，引起卵泡颗粒细胞的凋亡。郭毅炜等[30]将断乳至成熟期间的大鼠持续暴露于不同浓度赤霉素（GA3）时，结果显示在低、中、高剂量GA3 组的有腔卵泡数量与对照组相比有所下降，而闭锁卵泡数量上升。这与用棉酚培养大鼠卵巢的结果一致，实验表明在卵泡发育的所有阶段，用棉酚处理过的大鼠卵泡数量明显少于正常卵巢卵泡数量，证明棉酚会促进卵泡闭锁[31]。赵煜等[32]对注射5 mg/kg 玉米赤霉烯酮（ZEA）的大鼠卵巢颗粒细胞中Fas 及FasL 的动态变化表达进行检测，结果显示出总的上升趋势，推测ZEA 可能通过上调Fas/FasL 来促进卵巢颗粒细胞凋亡。

2.2.3 有机化合物 除了有毒物质，一些无毒性的有机化合物也会对卵泡颗粒细胞的正常生长造成损伤，引起卵泡闭锁。郝丽[33]使用不同剂量的乙醇对大鼠进行灌胃时发现，随着乙醇灌胃剂量的提升，大鼠卵巢颗粒细胞凋亡程度逐渐加深，浓度6%～7%乙醇可能是细胞凋亡的分界点，一旦超过这个分界点就会引起凋亡卵泡和黄体的比例显著升高。邻苯二甲酸单酯（MEHP）的暴露影响大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关基因的表达水平，通过上调Caspase-3、Caspase-7 蛋白水平并降低Bcl-2 蛋白水平，从而降低大鼠卵巢颗粒细胞的存活率[34]。此外，雷公藤甲素一方面通过抑制AKT 等信号通路、上调凋亡相关因子Caspase-3促进大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡，另一方面增加了大鼠卵巢颗粒细胞自噬小体以及自噬溶酶体数量，进而达到抑制卵泡发育的目的[35]。

由上述3 个外在因素可知，环境中存在的一些化学物质通过各种凋亡通路或直接或间接的影响卵巢的生殖功能，最终诱导卵泡颗粒细胞的凋亡。

2.2.4 辐射 目前，环境中辐射对人类的影响日益增加，因此对于它的研究也受到广泛关注。Lee 等[36]使用钴-60源，总剂量为7.2 Gy（戈瑞），剂量率为12.0 cGy/min的γ射线平均致死剂量（LD 50）对青春期前小鼠进行全身照射，在照射前的第0 d 和照射后的第1、2 和3 天，收集卵巢并评估形态变化发现，γ射线诱导小鼠卵巢卵泡的凋亡和变性。通过对不同状态下手机辐射对雌性小鼠生殖功能和应激反应的影响时发现，暴露于辐射下的小鼠发育和成熟卵泡以及黄体的数量明显减少，垂体促性腺激素、性腺类固醇的血清水平和类固醇生成因子-1（SF-1）、类固醇生成急性调节蛋白（StAR）以及孕酮的表达水平明显降低，手机辐射会诱发应激反应，从而影响雌性小鼠的生殖能力[37]。尉春华等[38]将在s 波平均密度分别为20 mW/cm2的高功率微波辐照实验组大鼠10 min，40 mW/cm2辐照5 min、10 min 后发现，其卵巢内部C-myc 蛋白和Bcl-2 蛋白表达升高，而40 mW/cm2组升高更为明显，推测出高功率微波辐射能够促进Bcl-2 蛋白以及C-myc 蛋白的活化和表达，进而诱导卵泡细胞的凋亡。

2.2.5 排卵方式 除了环境因素之外，某些人为因素也可能对卵泡颗粒细胞的生长或凋亡造成影响。陈艳婷等[39]研究不同促排卵方案对小鼠颗粒细胞凋亡的影响时发现，GnRH-a 和GnRH-ant 排卵方案促进小鼠颗粒细胞的凋亡，而PMSG 排卵方案相比空白组的凋亡蛋白表达有所下降，说明PMSG 方案可以抑制小鼠颗粒细胞凋亡。因此，选择合适的排卵方案能够减少卵泡闭锁数量，有助于颗粒细胞的正常生长。张芳[40]对大鼠卵巢卵泡进行重复超排卵，结果显示卵泡闭锁的速度增加，并且随着超排卵的次数增加闭锁速度越快。之后进一步研究发现重复超排卵通过降低卵巢凋亡抑制因子Bcl-2的表达使卵泡闭锁，并且这种效果随着超排卵次数的增加其降低的作用越发明显[38]，但由于凋亡基因Bax的表达没有明显变化，因此尚不能证明重复超排卵导致的卵泡闭锁是由Bcl-2/Bax所调节的。通过上述方式对卵泡颗粒细胞的生长和凋亡进行人为调控，是控制动物生产繁殖性能最直接的手段之一。

3 总结与展望

综上可知，啮齿动物卵泡颗粒细胞凋亡除了受到体内各种调节因子的影响外，环境中的某些物质也可能是造成凋亡的原因。但归其本质是某些刺激对凋亡基因进行激活和调控，使体内促凋亡基因的表达量增加，进而通过各种凋亡通路致使颗粒细胞发生凋亡。

细胞凋亡是一个正常的生理过程，对维持内环境平衡具有重要作用。深入研究卵泡颗粒细胞凋亡的机制，可以调控动物的发情周期，增加排卵卵泡的数目，从而达到提高受精率及繁殖率的目的,甚至还有助于进一步解析肿瘤以及癌症的作用机制，为今后的治疗打基础。