信 波,庞海林,申炜炜,宋晓鹏,彭文琦,张开亮

(1解放军第960医院泰安医疗区肿瘤科,泰安 271000;2空军军医大学第二附属医院肿瘤科;3解放军第960医院泰安医疗区心内科;4解放军第960医院泰安医疗区骨科;*通讯作者,E-mail:ZZ-KK-LL@126.com)

肺癌是目前世界上最常见的肿瘤,其发病率占全部癌症患者的11.6%,死亡率占全部癌症患者的18.4%,均居所有肿瘤的首位[1]。80%-90%肺癌的组织学类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[2]。雌激素是具有多种功能的类固醇激素,在从生殖到脂质代谢等众多生理过程中起着调节作用[3]。雄激素通过芳香化酶CYP19A1合成为雌激素,雌激素多通过与雌激素受体α(ERα)或雌激素受体β(ERβ)中的一个受体相互作用,发挥其基因组和非基因组生物学效应。这两种ER亚型虽然由不同的基因编码,但其具有相似的功能和结构域[4]。这两种受体在DNA和配体结合区显示出高度的序列同源性,它们与以雌二醇为主的内源性雌激素结合后的作用相似。除了介导生物学机制的动态平衡外,E2还在多种癌症的发生和恶性进展中发挥作用。雌激素在多种经典和非经典的激素敏感型肿瘤中都有具有明显的致癌作用,包括乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结肠癌和肺癌[5]。ERs位于肿瘤细胞的胞核和胞浆中,不仅能够促进细胞存活和增殖相关基因的转录调控,还可与生长因子途径中的诸如表皮生长因子(EGF)、胰岛素生长因子(IGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等发挥非基因组途径的相互作用[6]。由于上述的致癌机制,干扰E2信号通路的治疗方法,如选择性雌激素受体调节剂或降解剂(SERM或SERDs)和芳香化酶抑制剂(AIS),已被开发出来并在临床上用于治疗ER阳性的乳腺癌[3-5]。

近年来,雌激素在肺癌发生发展中所起的作用受到关注[5]。前期本课题组研究已证实了雌二醇通过雌激素β受体促进非小细胞肺癌A549细胞增殖[7]。那么,雌二醇对NSCLC细胞的迁移和侵袭能力会有怎样的影响呢?本实验通过探讨雌二醇对人非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭的影响,为其临床应用提供理论及实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

人类非小细胞肺癌细胞系A549、H1299(购自中科院上海细胞生物研究所);RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco,美国);E2(17β-雌二醇,Sigma,美国);PPT(雌激素受体α激动剂,Tocris,英国);DPN(雌激素受体β激动剂,Tocris,英国);Tranwell小室(Millipore,美国);Matrigel基质胶(BD Corning,美国)。

1.2 细胞培养及实验分组

常规使用RPMI-1640培养液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素)培养人非小细胞肺癌细胞系A549细胞和H1299细胞。每次取对数生长期的细胞进行实验。

根据本课题组前期研究中雌激素及其α和β受体激动剂对肺癌细胞增殖能力影响的相关实验结果[7],选择E2的作用浓度为10-8mol/L,PPT的作用浓度为10-8mol/L,DPN的作用浓度为10-8mol/L,以此作为给药剂量;且以未添加相应试剂的无血清培养基为对照组。将A549细胞和H1299细胞分别用4种试剂(Control、E2、PPT、DPN)各作用24 h和48 h后进行迁移和侵袭实验。为了排除完全培养基内血清中可能含有的激素对细胞生长的影响,在加入E2、PPT和DPN前24 h即用无血清培养基培养细胞,加入E2、PPT和DPN后继续用无血清培养基培养细胞。由于细胞在无血清培养基中无法正常分裂生长,所以本实验只观察加入E2、PPT和DPN后48 h(即无血清培养基培养细胞72 h)三者对细胞的影响。

1.3 侵袭实验

取对数生长期的A549细胞和H1299细胞进行侵袭实验。其中48 h组,在细胞置于Transwell小室上层前48 h时起,应用无血清培养基培养细胞;于细胞置于Transwell小室上层前24 h时加入实验分组相应试剂。而24 h组则在在细胞置于Transwell小室上层前24 h时起,应用无血清培养基培养细胞;细胞置于Transwell小室上层时加入实验分组相应试剂。消化细胞,PBS漂洗一遍后,用无血清培养液重悬细胞。用PBS稀释适量单细胞悬液后进行计数。用无血清培养液按1 ∶8比例将Matrigel基质胶稀释(提前将Matrigel基质胶置于4 ℃冰箱过夜融化)。将已预冷过的小室放入24孔板中,每个小室内加入100 μl稀释过的Matrigel基质胶,尽可能避免气泡产生。小室放入37 ℃培养箱内,静置30 min,以凝固基质胶。胶凝固后吸弃小室上层残余的少量液体,上室加入200 μl无血清培养液,下室加入500 μl无血清培养液后再次放入培养箱,水化30 min;吸弃Transwell小室上、下层内的无血清培养液。制备细胞悬液(5×105/ml),并吸取200 μl的细胞悬液加入小室上层,加入实验分组相应试剂。吸取600 μl完全培养基加入小室下层,放入培养箱,孵育24 h;吸弃上室和下室内的液体,用95%的酒精固定细胞10 min;弃去酒精,用棉签轻轻擦除上室的细胞和基质胶,用600 μl洁净、无杂质1%结晶紫对小室底面的细胞进行染色10 min,然后在流水中漂洗小室,将染料洗去后显微镜观察照相,每个小室随机选取5个视野进行计数和结果分析。

1.4 迁移实验

分组及操作同侵袭实验流程,但不铺Matrigel基质胶。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。所有实验结果采用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雌激素及其α和β受体激动剂对肺癌细胞侵袭能力的影响

应用Transwell小室侵袭实验来检测加药后肺癌细胞在体外的侵袭能力。结果提示,E2和DPN分别对A549细胞作用24 h后,对其侵袭能力无明显影响(P>0.05,见图1);E2和DPN对A549细胞作用48 h后,可以显著提高A549细胞的侵袭能力(P<0.05,见图1)。而雌激素及其α和β激动剂对H1299细胞的侵袭能力均无明显的影响(P>0.05,见图2)。

与control组相比,*P<0.05图1 E2、PPT、DPN对A549细胞侵袭能力的影响 (×200)Figure 1 Effects of E2, PPT and DPN on the invasion ability of A549 cells (×200)

图2 E2、PPT和DPN对H1299细胞侵袭能力的影响 (×200)Figure 2 Effects of E2, PPT and DPN on the invasion ability of H1299 cells (×200)

2.2 雌激素及其α和β受体激动剂对肺癌细胞迁移能力的影响

应用Transwell小室迁移实验来检测不同处理后肺癌细胞在体外的迁移能力。结果提示,E2和DPN分别对A549细胞作用24 h后,对其迁移能力无明显影响(P>0.05,见图3);E2和DPN对A549细胞作用48 h,可以显著提高A549细胞的迁移能力(P<0.05,见图3)。而PPT对H1299细胞作用24 h及48 h,均可明显抑制其迁移能力(P<0.05,见图4)。

与对照组相比,*P<0.05图3 E2、PPT和DPN对A549细胞迁移能力的影响 (×200)Figure 3 Effects of E2, PPT and DPN on the migration ability of A549 cells (×200)

与对照组相比,*P<0.05图4 E2、PPT和DPN对H1299细胞迁移能力的影响 (×200)Figure 4 Effects of E2, PPT and DPN on the migration ability of H1299 cells (×200)

3 讨论

雌激素是一类非常重要的甾体类性激素,通过与其不同的受体结合形成E2/ER复合物,从而促进机体的生长发育和维持多系统器官的功能,其受体主要包括ERα、ERβ两种亚型[8]。研究发现,在胎鼠发育和成年大鼠[9]肺组织细胞内,ERβ较ERα的mRNA表达量高。雌性ERβ knockout(-/-)小鼠出现肺畸形,在出生后3个月,小鼠的肺泡细胞减少和肺表面活性剂调节因子的表达下调。在出生后5个月时,雌性小鼠和雄性小鼠均表现出肺泡塌陷和细胞外基质改变等情况,这表明不论在雌性还是雄性小鼠体内,雌激素均对肺稳态具有一定的作用[10]。ERβ knockout(-/-)孕鼠暴露于多环芳烃后,雌性胎鼠而非雄性胎鼠未出现肺部肿瘤。ERE-luciferase reporter转基因小鼠在雌激素诱导后,雄性和雌性小鼠的肺内均出现了ERE-luciferase reporter的表达[11]。上述研究均表明肺是雌激素作用的靶器官,ERβ是肺内ER的主要功能受体。

据报道,肿瘤相关的ER在近30种不同类型的癌症中表达,主要在诸如乳腺、卵巢、子宫内膜和前列腺等激素敏感型肿瘤中表达[12]。通过比较肿瘤的临床病理特征及组织中ER蛋白表达情况(通常采用免疫组织化学评估)发现,因ER的细胞定位和肿瘤类型的不同,ER蛋白的表达与疾病预后有着极其复杂的关系。非小细胞肺癌中,ERα蛋白多在细胞质和细胞膜上表达,与肺癌预后不良有关;而细胞质内ERβ蛋白的高表达与较差的肿瘤生存期相关,提示ERβ在非小细胞肺癌相关的非基因组机制中具有优势。另外,在一些研究中,非小细胞肺癌细胞核内ERβ的表达与总生存期(overall survival,OS)呈正相关,而在另一些研究中呈负相关[13]。

那么,雌激素在非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭中又是通过与雌激素受体哪个亚型结合后发挥作用呢?

针对这一问题,本研究通过Transwell迁移和侵袭实验证实,E2及DPN促进A549细胞的迁移和侵袭能力,而对H1299细胞不具有类似的作用;而PPT对肺癌细胞的迁移和侵袭能力无明显的促进作用。综上,E2是通过ER起作用,当ERβ被激活时,可以促进A549细胞迁移和侵袭,而激活ERα对A549细胞则没有任何相应的作用,所以本研究的结果提示E2激活ERβ后可促进A549细胞在体外的迁移和侵袭。这为探索肺癌的发病机制以及寻找新的治疗靶点提供了实验依据。