甄洪涛 王朝亮

膀胱癌是临床常见的泌尿系统恶性肿瘤，在男性中发病率居于第6位，女性中居于第16位，近年来发病率和致死率均呈上升趋势[1]。目前，膀胱癌以手术切除结合化疗等综合治疗为主，但仍有较高的复发率，给患者生命健康造成严重威胁[2]。研究表明，上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤获得侵袭和迁移能力的主要原因之一，与病灶远端转移、复发及化疗耐药等不良预后关系密切[3]。目前关于膀胱癌细胞EMT调控机制尚未完全阐明，寻找针对性干预靶点，对改善疾病预后有重要意义。八聚体结合转录因子4(octamer blinding transcription fator 4，Oct4)B1是胚胎干细胞干性转录因子Oct4的主要亚型。近年来研究表明，Oct4在膀胱癌组织中呈高表达状态，且表达程度与膀胱癌转移及远期预后关系密切[4]。体外实验证实，Oct4B1基因过表达可增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力[5]。目前，关于Oct4B1基因对膀胱癌细胞EMT过程的影响研究尚少，本研究应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术沉默膀胱癌T24细胞Oct4B1基因，观察对细胞EMT过程的影响，并初步探讨其影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人膀胱癌T24细胞株，购自上海中科院细胞库，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，培养条件为37 ℃、5%CO2。

1.1.2 主要试剂和仪器 含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的Oct4B1-短发夹RNA(shRNA)质粒干扰载体、阴性对照质粒(上海吉玛制药技术有限公司)，蛋白激酶B激动剂(胰岛素样生长因子IGF-I，美国Abcam公司)，LipofactamineTM2000试剂盒、RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(日本Takara公司)，全蛋白提取试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)，Transwell小室(美国Corning Incorporated公司)，兔抗人Oct4B1多抗、兔抗人E-cadherin、Vimentin、N-cadherin单抗、兔抗人p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin单抗(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(北京中山金桥生物技术有限公司)。Varioskan LUX多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)，7300实时荧光定量PCR仪(美国ABI)，CheniDoc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组 取对数期T24细胞，调整细胞密度为1×105/ml，重新接种于6孔板，细胞再次融合达60%时，按照LipofactamineTM2000试剂盒说明书操作，将Oct4B1-shRNA质粒干扰载体、阴性对照质粒转入T24细胞中，分别设为shRNA组、shRNA-NC组，每组5个复孔，继续常规培养5 h后，更换培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640，继续培养至24 h，于荧光显微镜下观察转染效率。

另取转染至8 h的shRNA组、shRNA-NC组细胞，分别用AKT激动剂IGF-I(100 ng/ml)处理12 h，分别设为shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC+AKT激动剂组，每组5个复孔，然后更换常规培养基，继续培养至24 h进行后续实验。

1.2.2 Oct4B1 mRNA表达检测 收集转染至24 h的shRNA组、shRNA-NC组细胞及shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，按照RNA提取试剂盒说明说提取总RNA，并用逆转录试剂盒合成cDNA。设计PCR扩增引物序列：Oct4B1：F:5′-CTGATGCTGGAACGTTAGCTG-3′,R:5′-AGTAGCTGTGATGCGTGATGC-3′;β-actin：F:5′-TAGCTGATGCTGTGAAACCT-3′;R:5′-CTATGCTGTAGTGCTGATCG-3′。按照说明说设定反应体系，反应条件为：94 ℃预变性5 min；40个循环(94 ℃变性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸5 min。以β-actin为内参对照，2-△△CT为Oct4B1的相对表达强度。

1.2.3 侵袭能力检测 采用Transwell实验检测shRNA组、shRNA-NC组、shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞侵袭能力。Transwell小室滤膜由RPMI 1640培养基1∶6稀释的Matrigel包被，将小室放入24孔板，上层小室加入密度为2.0×105/ml各组细胞悬液200 μl，下层小室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。常规培养24 h，用无菌棉签擦去上层小室细胞，以0.1%结晶紫染色0.5 h，显微镜下计数5个随机视野中的穿膜细胞数，取平均值。

1.2.4 迁移能力检测 采用划痕实验检测shRNA组、shRNA-NC组、shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞迁移能力。取各组细胞以2×104/ml重新接种至24孔板，完全融合为单层细胞后，用20 μl无菌枪头划直线，PBS轻柔冲洗划痕边缘，记为0 h，加入完全培养基继续培养48 h，各组细胞于0 h和48 h分别取3个不同视野进行拍照，Image分析计算细胞迁移率(%)=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.5 上皮间质标记物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin及AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白表达检测 收集转染至24 h的shRNA组、shRNA-NC组细胞及shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞，PBC洗涤后转至离心管，按照全蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，并进行BCA蛋白定量。取40 μg待测蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳恒压分离，湿法转移至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后加入一抗稀释液(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin均为1∶1 000，p-AKT、p-GSK-3β为1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液(1∶10 000)，常温孵育2 h，以目的蛋白与内参对照β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 转染效率观察

瞬时转染48 h后，于光学显微镜和倒置荧光显微镜下观察并计算shRNA组和shRNA-NC组转染效率均>80%，可用于后续实验。

2.2 各组Oct4B1 mRNA相对表达量比较

RT-qPCR结果显示，shRNA组、shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组Oct4B1 mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.001)。与shRNA组比较，shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组Oct4B1 mRNA相对表达量均较高(P<0.05)；与shRNA+AKT激动剂组比较，shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组Oct4B1 mRNA相对表达量较高(P<0.05)，shRNA-NC+AKT激动剂组高于shRNA-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组Oct4B1 mRNA相对表达量比较

2.3 各组细胞侵袭能力比较

Transwell结果显示，shRNA组、shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组穿膜细胞数分别为(21.20±3.41)个/视野、(46.80±5.73)个/视野、(95.40±10.36)个/视野、(126.60±11.48)个/视野，组间比较，差异有统计学意义(F=158.530，P<0.001)。与shRNA组比较，shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组穿膜细胞数均较多，差异有统计学意义(t=8.585、15.212、19.680，均P<0.001)；与shRNA+AKT激动剂组比较，shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组穿膜细胞数均较多(t=9.179、13.907，均P<0.001)，且shRNA-NC+AKT激动剂组多于shRNA-NC组，差异有统计学意义(t=4.02，P=0.002)，见图1。

注：a为P<0.05，与shRNA组比较；b为P<0.05，与shRNA + AKT激动剂组比较；c为P<0.05，与shRNA-NC组比较。

2.4 各组细胞迁移能力比较

划痕实验结果显示，shRNA组、shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞48 h迁移率分别为(25.41±4.40)%、(33.88±5.87)%、(65.15±6.50)%、(86.64±9.38)%，组间比较差异有统计学意义(F=87.144，P<0.001)。与shRNA组比较，shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞48 h迁移率均较高，差异有统计学意义(t=4.211、10.622、13.215，P均<0.05)；与shRNA+AKT激动剂组比较，shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组细胞48 h迁移率较高(t=7.984、11.321，P均<0.001)，且shRNA-NC+AKT激动剂组高于shRNA-NC组，差异有统计学意义(t=2.582，P=0.033)。见图2。

注：a为P<0.05，与shRNA组比较；b为P<0.05，与shRNA + AKT激动剂组比较；c为P<0.05，与shRNA-NC组比较。

2.5 各组上皮间质标记物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量比较

E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与shRNA组比较，shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组E-cadherin蛋白相对表达量升高，Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与shRNA+AKT激动剂组比较，shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组E-cadherin蛋白相对表达量升高，Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；shRNA-NC+AKT激动剂组E-cadherin蛋白相对表达量高于shRNA-NC组，Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量低于shRNA-NC组(P<0.05)。见图3A，3B。

注：a为P<0.05，与shRNA组比较；b为P<0.05，与shRNA + AKT激动剂组比较；c为P<0.05，与shRNA-NC组比较。

2.6 各组AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路蛋白表达比较

p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与shRNA组比较，shRNA+AKT激动剂组、shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与shRNA+AKT激动剂组比较，shRNA-NC组、shRNA-NC+AKT激动剂组p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达量降低，且shRNA-NC+AKT激动剂组低于shRNA-NC组(P<0.05)。见图4A，4B。

注：a为P<0.05，与shRNA组比较；b为P<0.05，与shRNA + AKT激动剂组比较；c为P<0.05，与shRNA-NC组比较。

3 讨论

膀胱癌是一种直接威胁患者生命的疾病，目前，膀胱癌早期行手术切除联合术后药物灌注治疗效果较为理想，但仍面临病灶复发和转移的风险[6-7]。临床调查显示，膀胱浅表性癌经尿道切除术后仍有10%～60%的患者在12个月内复发，最终进展为肌层浸润性癌，预后生存期缩短，分析可能与膀胱癌EMT密切相关[8-10]。EMT是参与肿瘤侵袭和迁移的关键步骤，是指上皮细胞在外界诱因下向间质细胞转化的过程，该过程中细胞失去极性及细胞间黏附能力，同时获得运动特性，使癌细胞向远端转移能力及抗凋亡能力增强，从而增加治疗失败的风险[11-12]。因此，寻找抑制膀胱癌细胞EMT过程的针对性靶点，对膀胱癌的治疗有重要意义。

Oct4主要有3个亚型，Oct4A、Oct4B及Oct4B1，研究显示，Oct4B1在调节胚胎干细胞干性方面能力较其他亚型强，进一步发现，Oct4B1在包括膀胱癌在内的多种恶性肿瘤细胞中呈高表达状态，参与肿瘤的发生、发展[13-15]。Mirzaei等[16]研究认为，Oct4B1具有抗凋亡特性，有助于癌细胞逃避凋亡机制，可能通过调控抗凋亡基因的表达发挥作用。Zhou等[17]通过检测结直肠癌细胞中Oct4B1基因表达变化与EMT的关系，发现Oct4B1基因可能通过促进癌细胞EMT过程促进细胞自我更新，进而促进肿瘤复发、转移过程。上述研究均说明，高表达的Oct4B1基因有助于促进癌细胞发生EMT，增强细胞侵袭和迁移能力。本研究采用RNAi技术成功敲低膀胱癌细胞中Oct4B1基因，应用Transwell实验和划痕实验检测发现，shRNA组穿膜细胞数少于shRNA-NC组，48 h迁移率及E-cadherin蛋白相对表达量均低于shRNA-NC组，Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量高于shRNA-NC组，提示沉默Oct4B1基因可抑制T24细胞侵袭和迁移能力，抑制细胞EMT过程。

此外，本研究在RNAi沉默Oct4B1基因表达的基础上，应用AKT激动剂进行干预，结果显示shRNA-NC+AKT激动剂组及shRNA+AKT激动剂组Oct4B1 mRNA相对表达量、穿膜细胞数、48 h迁移率及E-cadherin蛋白表达均较shRNA-NC组、shRNA组升高，而shRNA+AKT激动剂组低于shRNA-NC+AKT激动剂组；Vimentin、N-cadherin及p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达与上述结果相反，提示AKT信号通路激活有助于促进膀胱癌细胞EMT过程，增强其侵袭和转移能力；而靶向沉默Oct4B1可抑制AKT激动剂诱导的EMT过程，降低其侵袭和转移能力，因此，沉默Oct4B1基因可能通过调控AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制癌细胞EMT过程。AKT/GSK-3β/β-catenin是诱发EMT的重要信号通路[18]。AKT磷酸化激活后，引起下游GSK-3β丝氨酸9(Ser9)磷酸化，从而失去与β-catenin结合能力，细胞内游离β-catenin增多进而转入细胞核，该信号通路被活化[19-20]。β-catenin可与E-cadherin形成复合体，以维持上皮细胞形态及细胞间黏附作用，β-catenin活化后复合体稳定性降低，导致细胞间连接松散，有利于细胞侵袭和转移[21]。

综上所述，沉默Oct4B1基因可抑制膀胱癌T24细胞EMT过程，抑制癌细胞侵袭和转移能力，沉默Oct4B1基因还能抑制AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导的EMT转化作用，为临床抑制膀胱癌的复发和转移提供了参考靶点。