石凤阳，李焕荣

(北京农学院动物科学技术学院/动物类国家级实验教学示范中心，北京 102206)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，被其感染猪以淋巴细胞凋亡和炎性细胞浸润为主要特点，机体免疫机能受到抑制[1]。其免疫抑制机理一直是PCV2研究的热点。PCV2感染在一定程度上减少了猪外周血CD4+T细胞的数量[2]。表现PMWS的猪肠中存在大量PCV2抗原，肠道出现炎性侵染现象[3]，PCV2能够在猪肠上皮细胞中增殖[4]。已有研究表明PCV2感染能够改变猪肠上皮细胞中炎性相关分子的表达[5-6]，此变化对CD4+T细胞的分化产生何种影响值得探索。

本研究拟通过PCV2感染的猪肠上皮细胞与CD4+T细胞共培养，模拟PCV2感染的猪肠上皮局部环境，研究PCV2感染猪肠上皮细胞对CD4+T细胞分化关键分子mRNA水平的影响，为进一步研究PCV2感染猪肠上皮细胞调控CD4+T细胞分化机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒和细胞

PCV2-SD 2008株(GenBank登录号：GQ174519)由河北农业大学动物传染病实验室分离鉴定并惠赠，105.5TCID50/mL。无PCV1/PCV2污染的PK-15细胞系由中国农业大学惠赠。猪肠上皮细胞系购自广州吉尼欧生命科技有限公司(源自DSMZ，货号No701)。

1.2 试验动物

3头30日龄经PCR或RT-PCR检测的猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒[3,6]均阴性的长白猪，购自北京市SPF猪育种管理中心。试验猪单独饲养于北京农学院动物房，自由采食与饮水，以备采血。该试验已通过北京农学院动物福利与伦理审查，编号为BUA2020092。

1.3 主要试剂与抗体

MS分选柱、MiniMACS Starting Kit、抗异硫氰酸荧光素磁珠抗体购自Miltenyi公司；异硫氰酸荧光素标记鼠抗猪CD4单抗，购自Invitrogen公司；鼠抗猪CD3单抗、鼠抗猪CD28单抗，购自Abcam公司；0.4 μm孔径的24孔细胞共培养板，购自Corning公司；反转录试剂盒、Ultra SYBR Mixture购自江苏康为世纪有限公司；病毒、细胞因子、转录因子的qPCR引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 PCV2感染猪肠上皮细胞

将处于对数生长期的猪肠上皮细胞分别接种至24孔培养板(3×104/孔)，待猪肠上皮细胞长至70%时常按规方法接种PCV2(MOI=1)，37 ℃吸附1 h，弃毒，洗涤3次。每孔加入500 μL或700 μL含10%胎牛血清的改良伊格尔培养基，用于之后的猪肠上皮细胞病毒载量检测或CD4+T细胞分化关键分子检测。继续培养48 h。

1.5 CD4+T细胞的分离

用淋巴细胞分离液对乙二胺四乙酸抗凝血进行密度梯度离心，400×g离心20 min。分离出外周血单个核细胞后，依次用异硫氰酸荧光素偶联的CD4单抗、异硫氰酸荧光素磁珠抗体标记，经MS柱阳选被标记的细胞，台盼蓝染色，纯度大于95%，计数并调整至5×106/mL，以备后用。

1.6 猪肠上皮细胞与CD4+T细胞共培养

将纯化的CD4+T细胞加入24孔板膜嵌套小室，将小室分别放入24孔板孔中。所有孔的小室均补培养液至300 μL，使CD4+T细胞为1.5×106/mL，并加入1 μg/mL的CD3/CD28单抗，继续培养72 h。

1.7 关键分子检测试验分组

试验分为共培养组与单独培养组，每一组均包含PCV2感染与对照。

共培养组PCV2感染孔为预先接种PCV2的猪肠上皮细胞，48 h后放入含CD4+T细胞的24孔板膜嵌套小室；对照孔为未接PCV2的猪肠上皮细胞，48 h后放入含CD4+T细胞的24孔板膜嵌套小室。

单独培养组PCV2感染孔预先不铺猪肠上皮细胞(仅加入700 μL培养液)，48 h后放入含CD4+T细胞的24孔板膜嵌套小室，同时加入同共培养组PCV2感染孔上清中相同量的病毒；对照孔预先不铺猪肠上皮细胞(仅加入700 μL培养液)，48 h后放入含CD4+T细胞的24孔板膜嵌套小室。

1.8 PCV2核酸载量与CD4+T细胞分化关键分子mRNA水平的检测

收集PCV2感染不同时间点猪肠上皮细胞进行PCV2核酸载量的检测；收集培养72 h的各组CD4+T细胞，提取RNA，进行各亚型关键细胞因子与转录因子mRNA检测。荧光定量PCR反应按照说明进行。反应体系20 μL：2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL，上游引物、下游引物各0.5 μL，模板2 μL；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。最后一个循环为95 ℃ 1 min，64 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，全程读板收集荧光信号。所用引物见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of fluorescent quantitative PCR

1.9 数据分析

采用SPSS 17.0分析软件进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，组间比较用t检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 猪肠上皮细胞中PCV2核酸载量的变化

PCV2感染猪肠上皮细胞后0、6、12、24、48和72 h，PCV2核酸载量持续升高。对照孔猪肠上皮细胞中未检测到PCV2核酸(结果未显示)。说明PCV2可感染猪肠上皮细胞，并在猪肠上皮细胞中增殖(图1)。

2.2 共培养组与单独培养组CD4+T细胞关键细胞因子mRNA水平的变化

共培养组与单独培养组CD4+T细胞关键细胞因子mRNA水平的变化见图2。为了探究感染PCV2的猪肠上皮细胞对CD4+T细胞关键细胞因子的影响，通过qPCR检测共培养组与单独培养组CD4+T细胞关键细胞因子的mRNA水平。选择PCV2感染猪肠上皮细胞后48 h与CD4+T细胞共培养，并于共培养后72 h收集细胞。

与对照孔相比，共培养组PCV2感染孔CD4+T细胞中IFN-γ mRNA表达量下调但无显著差异，IL-4、IL-17A、TGF-β1 mRNA水平显著下调，IL-10 mRNA水平显著上调，单独培养组各细胞因子变化与共培养组相反。

共培养组所得结果与单独培养组不同，提示PCV2感染猪肠上皮细胞后能对CD4+T细胞分化相关的多种细胞因子的mRNA水平产生影响。并非是感染猪肠上皮细胞后释放到培养液中的PCV2对CD4+T细胞的作用所致。

2.3 共培养组与单独培养组CD4+T细胞分化关键转录因子mRNA水平的变化

CD4+T细胞分化关键转录因子变化可解释CD4+T细胞分化情况。qPCR检测结果显示，与对照孔相比，共培养组PCV2感染孔CD4+T细胞的T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3 mRNA水平显著下调。单独培养组各转录因子变化与共培养组相反，提示共培养组所得结果与PCV2作用无关(图3)。

3 讨 论

通过建立猪肠上皮细胞与CD4+T细胞的共培养体系研究PCV2感染的猪肠上皮细胞对CD4+T细胞的影响，并根据PCV2感染后猪肠上皮细胞各炎性相关分子的表达情况[6]，于PCV2感染后48 h共培养。设立的共培养组与单独培养组的目的在于排除感染猪肠上皮细胞后释放到培养液中PCV2对CD4+T细胞分化的调控作用，明确共培养组结果为PCV2感染猪肠上皮细胞后诱导分泌的细胞因子对CD4+T细胞分化的调控。PCV2感染的猪肠上皮细胞在mRNA水平上抑制CD4+T细胞分化关键分子的表达，但上调IL-10的mRNA水平，提示CD4+T细胞向Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、调节性T细胞的分化被抑制，向分泌IL-10的CD4+T细胞的分化被促进。

CD4+T细胞在机体免疫功能中发挥重要作用，各亚型又有不同的功能。Th1细胞主要对包括病毒与细菌等的胞内病原产生应答，也在许多自身免疫性疾病中发挥作用[7-8]。Th1细胞分化需要IL-12和STAT1、STAT4以及T-bet存在，以高表达IFN-γ为主要特征[9]。Th1细胞关键转录因子T-bet的mRNA被显著抑制，IFN-γ mRNA水平无显著变化，推测可能是由于非炎症条件下各组Th1细胞分化水平均很低，IFN-γ表达量较低，导致其mRNA水平检测无显著差异。Th1细胞分化是否被抑制还需进一步的验证。

Th2细胞主要在寄生虫等胞外感染中发挥作用，也参与哮喘和过敏反应的发生，其分化需要IL-4和STAT6以及GATA3存在[10]，以表达IL-4、IL-5和IL-13等为主要特征[11]。

Th17细胞分化需要RORγt参与[12]，并以高表达IL-17A或IL-17F为主要特征[13]。

与Th17细胞分化相关的具有免疫调节功能的调节性T细胞，以高表达TGF-β为主要特征[14-15]。

Th2细胞关键转录因子GATA3和IL-4的mRNA被显著抑制，与Th17细胞相关分子RORγt和IL-17A，以及Foxp3和TGF-β的mRNA水平均显著下调，提示PCV2感染的猪肠上皮细胞可能抑制CD4+T细胞向Th2细胞、Th17细胞和调节性T细胞分化。此外，高表达IL-10的调节性T细胞-I型调节性T细胞[16]表达TGF-β，不产生IL-4与IL-17[17]，而本研究中PCV2感染的猪肠上皮细胞上调CD4+T细胞IL-10 mRNA水平，是否可表明共培养后的CD4+T细胞向I型调节性T细胞分化，值得探索。