申维维，吴 琼，胡 迪，温海京，胡 婷，范矿士，王建舫，张永红，崔德凤

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

中国畜牧业养殖在生产中抗生素、化药、激素等超量且不合理使用，使畜禽产品安全性降低[1]。益生菌在肠道中扮演着十分重要的角色，不仅可以调节肠道内微生物体系，还能保护机体肠道不受侵害，在发挥益生功能的同时产生活性物质和抑制有害菌物质[2]。

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)属于芽孢杆菌属，呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。最适生长温度为45～50 ℃，最适pH值6.6～7.0，在室温且避光的环境中其有效作用可长达720 d，主要具有“四耐”抗逆作用，具体表现为耐热、耐氧、耐盐、耐酸碱[3-4]。夏涛等[5]研究证明，在肉鸡养殖生产中，饲喂凝结芽孢杆菌，可显著改善肉鸡生长性能并能提高饲料碳水化合物和脂肪的消化。HUNG等[6]在饲养肉鸡的过程中添加凝结芽孢杆菌，结果表明该菌同样可显著提高肉鸡的生长性能并能改善肠道吸收功能。

本试验采取凝结芽孢杆菌BC-HYI饲喂肉鸡，探究凝结芽孢杆菌BC-HYI在实际饲养过程中是否能代替抗生素的使用，从而起到减少抗生素残留同时达到促进肉鸡生长，改善肠道功能的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凝结芽孢杆菌BC-HYI保存于北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室。3日龄健康雄性肉鸡(110～140 g)，共计75只，购自北京爱拔益加家禽育种有限公司，饲养于北京农学院球虫实验室动物房，室温25 ℃，湿度50%～60%。该试验已通过北京农学院动物福利与伦理审查，编号为BUA2021003。

超净工作台(东联哈尔制造公司)，电热恒温培养箱、全温振荡培养箱(上海一恒科学仪器公司)，电子天平(上海天平仪器厂)，4%多聚甲醛(Chiefeng公司)，苏木精伊红(HE)染色试剂盒(碧云天)，二甲苯无水乙醇(北京化工厂)，营养肉汤(北京奥博星)，麦康凯琼脂(北京奥博星)，MRS培养基(solarbio)，营养琼脂(solarbio)。

1.2 试验设计及分组

75只肉鸡经过适应性饲养3 d后，随机分为5组：对照组、抗生素组、凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组，每组15只。

对照组为基础日粮；抗生素组为基础日粮加杆菌肽；凝结芽孢杆菌低剂量组为基础日粮加凝结芽孢杆菌BC-HYI，细菌数2×107CFU/mL；凝结芽孢杆菌中剂量组为基础日粮加凝结芽孢杆菌BC-HYI，细菌数2×108CFU/mL；凝结芽孢杆菌高剂量组为基础日粮加凝结芽孢杆菌BC-HYI，细菌数2×109CFU/mL。

试验期35 d，每7 d为一个周期对试验肉鸡称量体质量、采血和剖检。

采用的日粮为无抗生素添加的基础日粮，主要由玉米和豆粕组成(表1)。

表1 基础日粮组成及营养水平Tab.1 Composition and nutritional level of basal diet

1.3 饲养管理

首先对鸡舍进行全面冲刷、消毒，提前2 d进行照射升温。试验肉鸡分层饲养，每天人工给料1次，自由采食，自由饮水，鸡舍内照射热灯，保障舍内适宜的温度和湿度，试验1～7 d鸡舍温度控制在32～34 ℃，之后鸡舍温度控制在25 ℃左右。鸡舍湿度为50%～60%，注意鸡舍卫生及合理通风。

1.4 样品采集与检测

1.4.1 样品采集和生长指标测定 肉鸡饲养第7天、第14天、第21天、第28天和第35天早8：00，肉鸡称量体质量，称量体质量前一天晚上禁食，自由饮水。在第14天和第28天时，每组取3只肉鸡剖检，取空肠、回肠、十二指肠肠道组织用4%多聚甲醛固定，固定24 h后进行包埋试验。每天记录给料质量，每组取3只肉鸡采血、剖杀，称取半净膛质量、全净膛质量，胸肌质量和腿肌质量，按照公式计算各项指标。

平均日采食量=采食量/试验时间

料重比=平均日采食量/平均日增体质量

胸肌率(%)=(两侧胸肌质量/全净膛质量)×100

腿肌率(%)=(两侧腿肌质量/全净膛质量)×100

1.4.2 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡肠道形态结构的影响 将空肠、回肠、十二指肠肠道制作组织切片并进行苏木精-伊红染色，电子显微镜下观察组织形态与结构。

绒毛高度：取肠绒毛顶部到底部的距离，取3个值，计算其平均数。

隐窝深度：肠黏膜肌层至肠腺开口，取3个值，计算其平均数。

1.4.3 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡盲肠内乳酸菌及大肠杆菌的影响 称取0.1 g盲肠内容物于灭菌的离心管中，吸取1 mL无菌生理盐水，充分混匀，再用灭菌的生理盐水进行10倍倍比稀释。

琼脂培养基：计数乳酸杆菌，称取27.5 g培养基于灭菌的三角瓶中，加500 mL去离子水，进行高压灭菌。

麦康凯培养基：计数大肠杆菌，称取26 g培养基于灭菌的三角瓶中，加入500 mL去离子水，微波炉加热溶解，进行高压灭菌。

采用倾注法计数：吸取0.1 mL进行稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的盲肠内容物稀释液至无菌平皿。

将高压灭菌的MRS、麦康凯培养基倒入加有稀释好的盲肠内容物平皿中，待培养基凝固后，放入37 ℃温箱，24 h后进行盲肠内乳酸菌及大肠杆菌的计数。

1.5 数据统计分析

试验数据均用SPSS20.0软件进行统计处理，结果用均值±标准差(Mean±SD)表示，用单因素方差分析差异显著性，主要分为四种：一是无显著差异(P>0.05)，二是有显著性差异P<0.05，三是有极显著性统计学差异(P<0.01)，最后是有非常显著性统计学差异(P<0.001)。

2 结 果

2.1 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡生长性能的影响

2.1.1 对肉鸡平均日采食量的影响 肉鸡平均日采食量随着饲养时间的增加呈逐渐上升的趋势，饲喂前期各组之间并没有显著差异(图1)。肉鸡饲养35 d时，抗生素组与对照组差异极显著(P<0.01)，凝结芽孢杆菌低剂量组非常显著高于对照组(P<0.001)。肉鸡在其他饲养时间内，凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组日采食量较对照组与抗生素组均无显著差异(P>0.05)。

2.1.2 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡料重比的影响 对肉鸡料重比的影响见图2。肉鸡饲养21 d时，凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组料重比显著低于对照组(P<0.05)。肉鸡饲养28 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组料重比显著低于对照组和抗生素组(P<0.05)。肉鸡饲养35 d时，凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组料重比显著低于对照组和抗生素组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌中剂量组料重比极显著低于对照组(P<0.01)。

2.2 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡屠宰性能的影响

对肉鸡屠宰性能的影响见表2。凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组，均呈现出不同程度提升肉鸡屠宰性能的作用。肉鸡饲养21 d时，抗生素组半净膛极显著高于对照组(P<0.01)；凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组半净膛均非常显著高于对照组(P<0.001)；凝结芽孢杆菌低剂量组半净膛极显著高于抗生素组(P<0.01)。肉鸡饲养28 d时，抗生素组、凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组半净膛均非常显著高于对照组(P<0.001)；凝结芽孢杆菌中剂量组半净膛极显著高于抗生素组(P<0.01)。肉鸡饲养35 d时，抗生素组、凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组半净膛均非常显著高于对照组(P<0.001)；凝结芽孢杆菌低剂量组半净膛显著高于抗生素组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌中剂量组半净膛极显著高于抗生素组(P<0.01)。

表2 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡屠宰性能的影响Tab.2 Effects of different concentrations of Bacillus coagulans BC-HYI on slaughter performance of broilers

肉鸡饲养21 d天时，凝结芽孢杆菌低剂量组全净膛极显著高于对照组与抗生素组(P<0.01)。肉鸡饲养28 d时，抗生素组与凝结芽孢杆菌低剂量组全净膛均极显著高于对照组(P<0.01)；凝结芽孢杆菌高剂量组全净膛非常显著高于对照组(P<0.001)。肉鸡饲养35 d时，抗生素组全净膛极显著高于对照组(P<0.01)；凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组组均非常显著高于对照组(P<0.001)；凝结芽孢杆菌低剂量组和凝结芽孢杆菌中剂量组全净膛非常显著高于抗生素组(P<0.001)。

肉鸡饲养28 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组腿肌率显著高于对照组(P<0.05)。肉鸡饲养35 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组腿肌率极显著高于对照组(P<0.01)；凝结芽孢杆菌中剂量组腿肌率显著高于抗生素组(P<0.05)。

肉鸡饲养14 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组胸肌率非常显著高于对照组(P<0.001)；凝结芽孢杆菌高剂量组胸肌率极显著高于对照组(P<0.01)。

2.3 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡肠道组织形态的影响

对肉鸡肠道组织形态的影响见表3。肉鸡饲养14 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组十二指肠的绒毛高度显著高于抗生素组(P<0.05)；抗生素组空肠绒毛高度显著低于对照组(P<0.05)，抗生素组空肠隐窝深度极显著低于对照组(P<0.01)，凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组空肠隐窝深度均显著高于抗生素组(P<0.05)；凝结芽孢杆菌高剂量组和抗生素组回肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05)。

肉鸡饲养28 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组十二指肠绒毛高度显著高于抗生素组(P<0.05)；抗生素组回肠绒毛高度显著低于对照组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌高剂量组回肠绒毛高度显著高于抗生素组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌中剂量组回肠隐窝深度显著低于抗生素组(P<0.05)；各组空肠绒毛高度和隐窝深度均未见显著差异。

肉鸡饲养14 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌高剂量组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值极显著高于对照组和抗生素组(P<0.01)；凝结芽孢杆菌中剂量组回肠绒毛高度/隐窝深度比值显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)。

肉鸡饲养28 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值极显著高于对照组和抗生素组(P<0.01)，凝结芽孢杆菌高剂量组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值显著高于对照组(P<0.05)。

2.4 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡盲肠内乳酸菌及大肠杆菌的影响

凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡盲肠内乳酸菌和大肠杆菌的影响见表4。

表4 凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡盲肠内乳酸菌及大肠杆菌的影响 lgCFU/mLTab.4 Effect of Bacillus coagulans BC-HYI on Lactobacillus and Escherichia coli of cecum

乳酸菌方面：肉鸡饲养7 d，各组之间没有显著差异；肉鸡饲养14 d，抗生素组显著低于对照组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组均显著高于抗生素组(P<0.05)；肉鸡饲养21 d，抗生素组显著低于对照组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌低剂量组和凝结芽孢杆菌高剂量组均显著高于抗生素组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌中剂量组极显著高于抗生素组(P<0.01)；肉鸡饲养28 d，凝结芽孢杆菌低剂量组显著高于对照组(P<0.05)，凝结芽孢杆菌中剂量组极显著高于对照组和抗生素组(P<0.01)。

大肠杆菌方面：肉鸡饲养7 d，凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组显著低于对照组(P<0.05)，且极显著低于抗生素组(P<0.01)；肉鸡饲养14 d，凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组显著低于对照组(P<0.05)，且极显著低于抗生素组(P<0.01)，凝结芽孢杆菌低剂量组显著低于抗生素组(P<0.05)；肉鸡饲养21 d，凝结芽孢杆菌中剂量组极显著低于对照组(P<0.01)，且显著低于抗生素组(P<0.05)；肉鸡饲养28 d，凝结芽孢杆菌中剂量组显著低于对照组和抗生素组(P<0.05)。

3 讨 论

畜禽的平均日采食量、平均日增体质量和料重比是反映益生菌制剂在实际应用中有效性和经济性的重要指标。申维维等[7]研究表明凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组均有不同程度提高肉鸡平均日增体质量的作用，这种促进作用在肉鸡饲养后期表现更为显著，肉鸡饲养28～35 d时，凝结芽孢杆菌中剂量组高于抗生素组，说明在平均日增体质量方面，凝结芽孢杆菌中剂量组在肉鸡饲养28～35 d时可以替代抗生素杆菌肽的促生长作用。从21 d起，凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组料重比与对照组比较显著降低，凝结芽孢杆菌BC-HYI促生长作用显著，且随着饲养时间的延长效果优于抗生素组。凝结芽孢杆菌BC-HYI抗逆性强，宜于在肠道生长繁殖，发挥益生作用。研究证明凝结芽孢杆菌BC-HYI具有较强的耐酸性和耐碱性[8]，其活性不会受胃酸和肠道的影响，能顺利进入机体的胃肠道，在肠道生长繁殖的过程中释放消化酶，促进机体对饲料的消化吸收，从而提高饲料利用率。KANWAR等[9]研究发现凝结芽孢杆菌在肠道内定植后会在肠道中释放消化酶和脂肪酶，这些脂肪酶有助机体消化一些不易被机体消化利用的物质，提高机体的营养水平。OU等[10]等研究发现凝结芽孢杆菌可以促进机体较难消化的碳水化合物吸收，从而帮助机体摄取更多营养物质。凝结芽孢杆菌产生挥发性脂肪酸和肽类抑菌物质。这些小分子有机酸有效促进肠道内矿物质的吸收[11]。本研究团队前期通过RT-HPLC技术，通过分析凝结芽孢杆菌BC-HYI代谢产物，发现含有L-乳酸、乙酸、甲酸、丙酸等有机酸[12]。

肠道是动物机体营养物质消化吸收的主要场所，肠道的结构及菌群种类与肠道功能有十分密切的关系[13]。凝结芽孢杆菌维护肠道屏障，提升机体免疫功能。常用绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度和隐窝深度的比值来判断肠道的健康状态。当绒毛高度增高时，说明绒毛中成熟的上皮细胞越丰富，反映出肠道的消化吸收功能越强[14]；隐窝深度主要影响肠上皮细胞的生成速度，处于隐窝基层的细胞具有分化能力，可以分化出许多新的细胞，这些新产生的细胞会逐渐迁移到绒毛顶端，最后变为肠上皮细胞，帮助机体消化营养物质[15-16]。当肠道隐窝深度变低时，隐窝底部分化出来的细胞到绒毛顶端的路程就会缩短，肠上皮细胞产生、更新的速率也会加快，进而增强肠道的吸收能力；当绒毛高度/隐窝深度比值降低时，说明小肠内肠黏膜可能受到损伤，导致小肠的吸收能力下降，反之，当绒毛高度/隐窝深度比值升高时，说明小肠内结构良好，肠黏膜完整，吸收功能提升[17-18]。王政等[19]发现饮水中添加106CFU/mL的凝结芽孢杆菌，具有增加白羽鸡盲肠中的乳酸菌数量，抑制大肠杆菌生长，有效改善肠道中微生物体系的作用，并显著提高白羽鸡空肠的绒毛高度/隐窝深度比值，改善白羽鸡肠道的消化吸收功能，与本研究结果一致。

4 结 论

2×108CFU/mL凝结芽孢杆菌BC-HYI可以改善肠道形态结构，调节盲肠内乳酸菌和大肠杆菌的生长；对肉鸡具有显著促生长作用。