黄 昊，何涓源，赖思婷，陈利忠，冯艳丽，余 翔,*

（1.浙江恒通生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313014；2.湖北师范大学生命科学学院，食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002）

青虾（Macrobrachium nipponense）学名日本沼虾，是我国及东南亚国家特有的经济养殖虾类，其味道鲜美且具有高蛋白、低脂肪的营养特点[1]，深受消费者的青睐，市场需求量逐年扩增，但新鲜青虾捕获离水后极易死亡，且由于其肌肉含水量高、营养丰富，在冷藏过程中极易发生腐败变质[2]，如何延长其冷藏货架期是青虾产业发展中面临的瓶颈问题。

近年来，众多学者围绕虾类生鲜水产品的保鲜开展了大量的研究，研发出天然保鲜剂保鲜[3]、气调保鲜[4]和辐照保鲜等技术应用于生鲜水产品的保鲜，其中天然保鲜剂以其安全、高效、成本低且容易操作等优点备受研究人员关注，各种具有成膜、抑菌和抗氧化等作用的天然物质如壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物、乳酸链球菌素（Nisin）、茶多酚等被逐步开发并应用于生鲜水产品的保鲜中，并取得了较好的保鲜效果。但研究也表明，使用单一天然保鲜剂进行生鲜水产品保鲜时，往往会出现保鲜剂用量过大但保鲜效果有限的现象，且不能有效的抑制或杀死食品中的腐败和致病微生物。而根据栅栏技术的原理，将不同种类的天然保鲜剂进行复配，可发挥不同天然保鲜剂的协同效应，使保鲜效果大幅提升[5]。

课题组前期通过正交试验将壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物和乳酸链球菌素（Nisin）四种天然保鲜剂组分进行复配优化，开发出一种适用于青虾冷藏保鲜的复配天然保鲜剂（壳聚糖12.5 g/L、卡拉胶1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L），该保鲜剂可以大幅延长青虾的冷藏货架期。为尽快将该青虾复配天然保鲜剂应用于生产实际中，本试验对采用该复配天然保鲜剂涂膜处理的青虾在冷藏过程中pH 值、挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen, TVB-N）、硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）值、菌落总数等理化指标进行检测，同时结合青虾肌肉蛋白的SDS-PAGE 电泳研究肌肉蛋白质结构和性质的稳定性，全面评价该复配天然保鲜剂对青虾保鲜效果的影响，为进一步的产业化实施提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

本研究所用青虾来自浙江恒通生物科技股份有限公司养殖基地，捕捞后在青虾处于鲜活状态下运输至实验室进行后续样品保鲜处理。

壳聚糖（脱乙酰度＞90%）、迷迭香提取物、卡拉胶和乳酸链球菌素（以上均为食品级），购于河南圣斯得实业有限公司；硼酸、氧化酶、硫酸、氢氧化钠等化学试剂，购于国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

K9860 型全自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司；BCM-1300A 型生物洁净工作台，苏净集团安泰公司；CP114 型电子天平，美国奥豪斯仪器（上海）有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 复配天然保鲜剂的配制及样品处理方法

1.2.1.1 复配天然保鲜剂配制方法

参照课题组前期研究所获得的复配天然保鲜剂配方（壳聚糖12.5 g/L、卡拉胶1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L）进行配制。根据配方称取相应质量的壳聚糖粉末，用1%醋酸溶液溶解制成壳聚糖溶液，再按照配方称取相应质量的迷迭香提取物、卡拉胶和乳酸链球菌素溶解于壳聚糖溶液中，搅拌均匀制成复配天然保鲜剂，4 ℃贮藏备用。

1.2.1.2 样品处理方法

试验组：将50 尾大小一致的新鲜青虾洗净、沥干，将青虾在复配天然保鲜剂溶液中浸渍10 min，料液比为1∶2（g/mL）。捞出后于4 ℃沥干30 min，逐只用小号保鲜袋分装，4 ℃冷藏备用。

对照组：将50 尾大小一致的新鲜青虾洗净、沥干，分装至保鲜袋，4 ℃冷藏备用。

冷藏当天，取6 尾清洗、沥干后的新鲜青虾，去头、剥壳后取尾部肌肉进行相关指标测定，所测值作为青虾原料保鲜初始值。从冷藏第1 天起，每日分别从试验组和对照组各取6 尾青虾，取其尾部肌肉进行相关保鲜指标测定。

1.2.2 测定项目与方法

1.2.2.1 pH 值

参照GB 5009.237—2016[6]规定的方法对样品进行测定。

1.2.2.2 挥发性盐基氮（TVB-N）值

参照GB 5009.228—2016[7]规定的方法，采用自动凯氏定氮法对样品进行测定。

1.2.2.3 硫代巴比妥酸反应物含量（TBARS）值

参照GB/T 35252—2017[8]规定的方法对样品进行测定。

1.2.2.4 菌落总数

参照GB 4789.2—2016[9]规定的方法对样品进行测定。

1.2.2.5 肌肉蛋白质结构和性质的稳定性检测

青虾肌肉蛋白的提取：参考Pang 等[10]的方法，将青虾尾部肌肉取出绞碎，准确称取1 g 置于50 mL 离心管中，加入10 mL 50 mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.2,0.55 mol/L KI）, 匀浆后置于4 ℃摇床上浸提20 h，然后以4 200 r/min 离心30 min，收集上清液即青虾肌肉蛋白提取液，备用。

肌肉蛋白质SDS-PAGE 电泳：参考Pang 等[10]的方法，采用SDS-PAGE 分析复配天然保鲜剂涂膜处理对青虾冷藏过程中肌肉蛋白质变化的影响。配制质量分数12%的分离胶和4%的浓缩胶对青虾肌肉蛋白提取液进行SDS-PAGE 电泳分析, 电泳结束后，经考马斯亮蓝染色，脱色后观察蛋白质条带变化。

1.2.3 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0 统计软件的One-way ANOVA 程序进行数据分析，结果以平均值±标准偏差表示，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 冷藏过程中青虾肌肉pH 值的变化

pH 值是衡量肉质新鲜程度的重要依据[11]，复配涂膜试验组青虾冷藏过程中pH 值的变化见图1。青虾新鲜原料初始pH 值为7.15，在冷藏第1 天，对照组和复配涂膜组青虾样品的pH 值均略微下降，可能与冷藏初期青虾经历僵直和解僵过程，体内糖原和ATP 分解产生乳酸、磷酸等酸性物质，使得肌肉pH值下降有关[12]，复配涂膜组青虾pH 值低于对照组，可能是在青虾涂膜和冷藏过程中，复配天然保鲜剂中的少量醋酸组分渗透进虾肉所致。从冷藏第2 天开始，两组青虾样品的pH 值均开始呈现上升趋势。众多研究证明，在肉品自溶期开始后，肌肉内源及微生物来源蛋白酶的共同作用促使肌肉蛋白质发生降解产生胺类等碱性物质，引起肌肉pH 值上升，是肉品开始腐败变质的重要特征[13-14]。冷藏的2～8 d，复配涂膜组青虾肌肉pH 值均低于对照组，说明复配天然保鲜剂中的壳聚糖、迷迭香提取物和Nisin 等抗菌组分对青虾内腐败微生物的生长具有抑制作用，延缓了冷藏过程中由于微生物生长导致的青虾腐败现象的发生。甘晖等[15]研究表明，壳聚糖和茶多酚等天然保鲜剂能改变南美白对虾冷藏中的微生物区系，降低腐胺、尸胺等碱性物质含量，抑制南美白对虾冷藏过程中的品质恶化，本研究结果与其一致。

图1 4 ℃冷藏期间青虾肌肉pH 值的变化Fig.1 The variation of muscle pH value of M.nipponense muscle stored at 4 ℃

2.2 冷藏过程中青虾肌肉TVB-N 值的变化

TVB-N 是动物源水产品在酶和微生物的作用下，使其肌肉蛋白质发生腐败而分解产生的氨及胺类等碱性物质，是评价动物性水产品新鲜程度的重要参数之一[16]。我国相关水产品卫生标准规定，淡水鱼虾TVB-N≤20 mg/100 g 为可接受范围，其中TVB-N≤10 mg/100 g 为一级鲜度标准[17]。复配涂膜试验组青虾冷藏过程中TVB-N 值的变化见图2。新鲜青虾TVB-N 值为6.80 mg/100 g，符合一级鲜度要求。冷藏过程中对照组和复配涂膜组的TVB-N 值均呈上升趋势。冷藏第4 天时，对照组青虾的TVB-N 值达到20.40 mg/100 g，已失去食用价值，而复配涂膜组在冷藏第7 天其TVB-N 值为19.49 mg/100 g，仍在国家标准的限定范围内。该结果表明，在青虾冷藏过程中，复配天然保鲜剂抑制了微生物的生长繁殖，降低了因微生物腐败造成的氨和胺类等碱性物质的产生，延长了青虾冷藏货架期。Liu 等[18]将壳聚糖、丁香精油和曲酸复配涂膜南美白对虾，在冷藏过程中，试验组青虾TVB-N 值的增长被抑制，这与壳聚糖能抑制腐败微生物的生长，进而延缓肌肉蛋白质腐败降解有关。相关的一些研究也证明，迷迭香提取物[19]和Nisin[20]具备较好的抑菌性能，用于水产品冷藏中具有较好的保鲜效果。

图2 4 ℃冷藏期间青虾肌肉TVB-N 值的变化Fig.2 The variation of muscle TVB-N value of M.nipponense stored at 4 ℃

2.3 冷藏过程中青虾肌肉TBARS 值的变化

水产品肌肉中含有大量不饱和脂肪酸组分，在冷藏过程中容易发生脂肪氧化进而影响水产品感官和肉质品质，因此，在水产品冷藏过程中控制其脂肪氧化程度是保鲜的关键。硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）可与脂质氧化产生的的丙二醛（Malondialdehyde,MDA）形成稳定的红色物质，通过显色反应可以定量评价水产品脂肪氧化的程度[21]。目前，我国尚没有明确规定水产品中TBARS 限量标准，但国外相关研究推荐水产品中丙二醛的含量阈值为1～2 mg/kg[22]。复配涂膜试验组青虾冷藏过程中TBARS值的变化见图3。随着冷藏时间的延长，对照组和复配涂膜组青虾的TBARS 值均呈上升趋势，但复配涂膜组青虾的TBARS 值始终低于对照组。冷藏第6 天时，对照组青虾肌肉TBARS 值达到2.04 mg/kg，超过建议限量标准；而复配涂膜组青虾冷藏第8 天，其TBARS 值为1.81 mg/kg，仍在建议限量范围内。以上结果表明，该复配天然保鲜剂处理能有效延缓青虾肌肉中的脂肪氧化速率，有利于青虾的冷藏保鲜。分析原因有以下两点：首先，复配天然保鲜剂中的壳聚糖组分具有良好的成膜性，能在青虾表面形成致密的可食性膜，隔绝了青虾肌肉与氧气的接触。其次，复配天然保鲜剂中迷迭香提取物富含迷迭香酚、鼠尾草酚和鼠尾草酸等组分，对脂肪的抗氧化效果良好。Ozogul等[19]和刘金昉等[23]的研究也证明了这一观点。

图3 4 ℃冷藏期间青虾肌肉TBARS 值的变化Fig.3 The variation of muscle TBARS value of M.nipponense stored at 4 ℃

2.4 冷藏过程中青虾菌落总数的变化

微生物生长是水产品冷藏过程中发生腐败变质的主要原因，菌落总数是评价水产品腐败程度的重要依据。Cai 等[24]和Manju 等[25]研究表明，水产品中菌落总数的卫生标准限量值为7 lg(CFU/g)，并建议将该值作为评价水产品货架期终点的标志。复配涂膜试验组青虾冷藏过程中菌落总数的变化见图4。随着冷藏时间的延续，对照组和复配涂膜组青虾的菌落总数均呈上升趋势，且复配涂膜组始终低于对照组。冷藏第6天，对照组青虾菌落总数就已达到7.17 lg(CFU/g)，说明青虾已不具备食用价值，而复配涂膜保鲜组青虾在冷藏第8 天时，其菌落总数为6.81 lg(CFU/g)，仍在卫生限量标准范围内，可见该复配天然保鲜剂对青虾冷藏过程中微生物的生长繁殖起到较好的抑制效果，有利于青虾的冷藏保鲜。分析原因可能是由于新鲜青虾经过复配天然保鲜剂涂膜处理后，保鲜剂中的Nisin组分能够有效抑制微生物的生长，再加之壳聚糖在青虾表面形成的可食性膜可最大化地隔绝虾体与空气的接触，抑制好氧微生物的生长。研究表明，鲜虾原料中腐败菌主要以假单胞菌、气单胞菌、不动杆菌和黄杆菌等好氧微生物为主[26-28]，据此推断本研究采用的复配天然保鲜剂对青虾原料具有非常好的抑菌效果，能极大地延缓冷藏过程中青虾的腐败变质速度。

图4 4 ℃冷藏期间青虾肌肉菌落总数的变化Fig.4 The variation of total bacterial count of M.nipponense stored at 4 ℃

2.5 冷藏过程中青虾肌肉蛋白质SDS-PAGE 的变化

水产品在冷藏保鲜过程中，受到内源和微生物来源的蛋白酶共同作用，其肌肉蛋白质会发生降解产生分子量较小的蛋白质、肽类和氨基酸等，导致水产品腐败变质，因此，可以根据肌肉蛋白质SDS-PAGE 中蛋白条带的变化来判断水产品的新鲜程度。图5 所示，随着冷藏时间的延长，对照组中肌球蛋白重链和副肌球蛋白条带均逐步变细，在第5 天两条蛋白质条带轮廓已不明显，第8 天均消失。肌动蛋白和肌动蛋白轻链条带在第1 天后基本看不到轮廓，原肌球蛋条带在整个冷藏期间不断变浅。说明在冷藏过程中，对照组青虾肌肉大分子蛋白质不断降解，青虾品质变劣。姚洁玉等[29]对凡纳滨虾的保鲜研究也显示同样的结果。复配涂膜组青虾蛋白图谱中a、b、c、d、e 这5 条蛋白条带在整个冷藏期间变化不明显，说明复配保鲜剂处理能够延缓青虾肌肉蛋白质降解，有利于其冷藏保鲜。陈赛等[30]研究表明，壳聚糖、茶多酚和溶菌酶的复配保鲜剂能够维持草鱼肌肉蛋白质的结构和性质的稳定性，从而延缓冷藏过程中草鱼肌肉质量的下降，本研究结果与之相似。

图5 4 ℃冷藏期间青虾肌肉蛋白质的SDS-PAGE 图谱Fig.5 SDS-PAGE pattern of muscle proteins of M.nipponense stored at 4 ℃

3 结论

采用复配天然保鲜剂（壳聚糖12.5 g/L、卡拉胶1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L）处理青虾，并在4 ℃冷藏，青虾的pH 值、TVB-N 值、TBARS值和菌落总数均大幅低于对照组，说明该复配天然保鲜剂能够有效抑制青虾冷藏过程中肌肉蛋白质的分解、脂肪的氧化酸败和微生物的增殖，青虾冷藏过程中肌肉蛋白质SDS-PAGE 结果也证明，复配天然保鲜剂有利于维持青虾肌肉蛋白质的结构和性质的稳定性，从而延缓青虾的腐败变质，保鲜效果十分明显。本研究在证明该复配天然保鲜剂的合理性和科学性的同时，也为其他基于壳聚糖涂膜的复配天然保鲜剂开发提供研究思路和借鉴。