徐 纬,李 军,胡 勇,于 春,秦 旭,罗茹丹

(贵州医科大学 公共卫生学院,环境污染与疾病监控教育部重点实验室,贵阳 550025)

锌、铜、铁等微量元素与人体健康关系密切[1-6],在过往研究中,研究者主要探讨微量元素总量与疾病的关系,对元素形态检测的关注较少。微量元素在机体组织中的存在形态多样,主要以与生物大分子结合的形态和自由离子形态存在[7],仅检测组织中元素总量难以准确反映微量元素对疾病的影响机制,且体内微量元素主要以与蛋白结合的形态发挥生物学效应,故元素蛋白结合态检测对疾病预防、诊断、治疗及其机制研究具有更重要的价值。

血液和尿液是疾病研究与诊治的重要检测对象,其元素分析方法很多[8-13],主要以原子吸收光谱法(AAS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)应用较广泛,但ICP-AES的高纯氩气消耗量大,检测成本较高。AAS目前以连续光源技术较为先进,与锐线光源技术相比,其背景校正更精准,检出限更低,在多元素测定时无需更换空心阴极灯[14-16]。

血清中元素形态分为蛋白结合态和非蛋白结合态,元素与蛋白质结合而存在的形态称为元素蛋白结合态,其他存在形态皆称为元素非蛋白结合态。目前国内外关于血清中元素蛋白结合态测定的相关研究较少。在已报道的方法中[17-19],其前处理方法基本相同,测定元素总形态时采用1%(体积分数,下同)硝酸溶液直接稀释血清,测定非蛋白结合态时采用无水乙醇沉淀分离蛋白质,但存在血清样本消耗量较大、多元素测定时操作复杂、石墨炉法分析速率慢等问题。本工作以Sprague Dawley(SD)大鼠血清为方法学试验对象,对上述前处理方法进行了改进,探索建立了连续光源火焰原子吸收光谱法同时测定血清中锌、铜、铁等元素蛋白结合态含量的方法,降低了血清样本消耗量,可供临床检验和疾病基础研究中血清蛋白结合态多元素同时测定时参考使用。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Contr AA700 型连续光源火焰原子吸收光谱仪;Mettler Toledo AB265-S 型电子天平;Milli-Q型超纯水仪;QL-861型漩涡混合器;Z36HK 型高速冷冻离心机。

锌、铜、铁单元素标准储备溶液:1 000 mg·L－1。

锌、铜、铁混合标准储备溶液:5.00 mg·L－1,移取1 000 mg·L－1锌、铜、铁单元素标准储备溶液各0.50 mL,用1%硝酸溶液稀释,定容至100 mL容量瓶中,摇匀,配制成质量浓度为5.00 mg·L－1的锌、铜、铁混合标准储备溶液。

硝酸、无水乙醇均为优级纯;试验用水为超纯水(电阻率大于18.2 MΩ·cm)。

SD 大鼠(8周龄,雄性,贵州医科大学实验动物中心提供)。

1.2 仪器工作条件

乙炔-空气(C2H2-Air)火焰;燃烧器高度为6 mm;助燃气流量为470 L·h－1。锌、铜、铁等元素测定的其他仪器工作参数见表1。

表1 仪器工作参数Tab.1 Working parameters of the instrument

1.3 试验方法

1.3.1 血清中锌、铜、铁总形态含量测定

取SD 大鼠血清0.5 mL,加入0.25 mL硝酸,静置10 min,用水稀释至25 mL,摇匀,按仪器工作条件测定;以水为空白样品,同法做试剂空白试验。

1.3.2 血清中锌、铜、铁非蛋白结合态含量测定

取上述相同SD 大鼠血清0.5 mL,加入65%(体积分数,下同)乙醇溶液6.0 mL,漩涡混匀5 min,以转速10 000 r·min－1离心5 min,上清液用0.45μm 有机系滤头过滤。取滤液5.0 mL,用2%(体积分数)硝酸溶液稀释至10 mL,摇匀,按仪器工作条件测定;以水为空白样品,同法做试剂空白试验。

1.3.3 血清中锌、铜、铁蛋白结合态含量的计算

血清中元素蛋白结合态含量等于该元素总形态含量减去其非蛋白结合态含量。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

血液中铁元素主要分布于红细胞中,在样本采集和血清制备时要避免发生溶血现象。

2.1.1 测定血清中元素总形态含量和非蛋白结合态含量的前处理方法

在测定血清中元素总形态含量时,若血清直接用1%硝酸溶液稀释定容[18-19],则血清溶液在较长时间内呈浑浊状;而试验选择先在血清中加入适量硝酸,静置10 min,使血清中有机质消解,再用水稀释,使介质相当于1%硝酸溶液,所得血清溶液澄清。

在测定血清中元素非蛋白结合态含量时,需确保血清中蛋白质沉淀完全且蛋白结合态元素不脱落、非蛋白结合态元素不发生沉淀反应,因此血清蛋白质沉淀剂的选择较为关键。试验发现,在血清中直接加入蛋白质沉淀剂无水乙醇时[17-19],沉淀速率较快,未能形成疏松细小沉淀,另血清具有一定的黏稠度,沉淀将可能包裹少量血清和游离元素。试验选择在0.5 mL 血清中加入65%乙醇溶液6.0 mL[相当于介质为60%(体积分数)乙醇溶液],此时蛋白质沉淀率较高[18-19],且血清溶液能在快速混匀过程中温和地形成疏松细小的蛋白质沉淀,当漩涡混匀时间大于3 min时,元素非蛋白结合态含量趋于平衡,最终确定漩涡混匀时间为5 min。

2.1.2 分离蛋白质沉淀的前处理方法

在分离蛋白质沉淀时,不同分离方法对元素非蛋白结合态含量测定影响较大。滤膜过滤法能有效分离沉淀,但蛋白质沉淀容易堵塞滤膜;离心分离法操作简便,但在吸取上清液时容易吸入少量沉淀而影响测定结果。因此,试验采用先离心后过滤的沉淀分离方法,以保证元素非蛋白结合态含量测定的准确性。为避免不同硝酸介质浓度对测定产生影响,试验在制备供试品溶液时均控制介质硝酸溶液的体积分数为1%。

2.2 标准曲线和检出限

移取锌、铜、铁混合标准储备溶液,用1%硝酸溶液逐级稀释,配制成质量浓度为0.01,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50 mg·L－1的混合标准溶液系列,按仪器工作条件测定。以各元素的质量浓度为横坐标,其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:锌、铜、铁的质量浓度在0.01～0.50 mg·L－1内与其对应的吸光度呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表2。

按1.3.1节和1.3.2节试验方法分别制备空白溶液,在仪器工作条件下连续测定11次,计算测定值的标准偏差(s)。以3倍标准偏差与相应标准曲线斜率(k)之比计算方法的检出限(3s/k),结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.3 精密度试验

精密度试验对血清样本需求量较大,需进行多只SD 大鼠血清混匀以制成足够量的均质血清,混匀操作需缓慢,避免产生泡沫。试验采集SD 雄性大鼠血清约15 mL,充分混匀后,按1.3.1 节和1.3.2节试验方法分别制备6份供试品溶液,按仪器工作条件测定,计算血清中锌、铜、铁元素总形态含量、非蛋白结合态含量、蛋白结合态含量及测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。其中代表6次测定值的平均值±标准偏差(s)。

表3 精密度试验结果(n＝6)Tab.3 Results of test for precision(n＝6)

由表3可知,血清中锌、铜、铁元素总形态、非蛋白结合态和蛋白结合态测定值的RSD 均小于5.0%,说明方法的精密度较好。

2.4 回收试验

取12份SD 大鼠均质血清各0.5 mL,均分为4组,分别加入1.00 mg·L－1混合标准溶液0,0.20,0.40,0.60 mL,按1.3.1节试验方法进行前处理,按仪器工作条件测定,计算元素总形态的加标回收率,结果见表4。

另取12份上述血清各0.5 mL,均分为4组,分别加入65%乙醇溶液6 mL,漩涡混匀5 min,分别加入1.00 mg·L－1混 合标准溶 液0,0.20,0.40,0.60 mL,按1.3.2节试验方法进行后续处理,按仪器工作条件测定,计算元素非蛋白结合态的加标回收率,结果见表4。

表4 回收试验结果Tab.4 Results of test for recovery

结果表明:在进行非蛋白结合态加标回收试验时,若先在血清中加入混合标准溶液,锌和铜的回收率略偏低,这可能是血清蛋白再次结合了少量加入的元素,因此试验先沉淀血清蛋白后再加入混合标准溶液,获得了较为理想的回收率;元素总形态和非蛋白结合态的含量测定方法准确度较高,加标回收率为95.3%～104%,进而保证了元素蛋白结合态含量测定结果的准确性。

2.5 样品分析

取3只同批次健康SD 大鼠,在相同条件下采集血清,每只SD 大鼠血清均按1.3节试验方法分别制备供试品溶液,按仪器工作条件测定,每只SD大鼠平行测定2次,计算每只SD 大鼠血清中锌、铜、铁各元素总形态、非蛋白结合态和蛋白结合态含量,结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of samples

结果表明:大鼠血清中锌和铜元素主要以蛋白结合态存在,在总形态中占比在60%以上,铁元素蛋白结合态占比相对较少。

本工作建立了一种连续光源火焰原子吸收光谱法同时测定血清中锌、铜、铁元素蛋白结合态含量的方法。试验操作简单,引入干扰较少,具有较好的灵敏度、精密度和准确度,可为临床检验和疾病基础研究中蛋白结合态多元素的同时测定提供参考。