龙若庭，陈淑霞，林萃，罗华玉，李恋湘，李淑娜

珠海市妇幼保健院检验科，广东珠海 519001

当个体内存在两种或两种以上不同核型的细胞系时，称为嵌合体。研究［1-2］发现，嵌合体中异常核型比例越高，细胞畸变发生越早，致畸越严重，临床症状越明显。因此，嵌合体是导致胎儿出生缺陷的常见原因之一。嵌合体的检测需经细胞培养和繁琐制片染色过程，检测比较耗时，且其对＜5 Mb的染色体片段分辨率较低，所以小片段染色体异常的临床检测存在局限性。荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QFPCR）技术可通过扩增染色体上短串联重复序列（STR）位点来比较遗传物质的拷贝数，判断相应染色体的数目，提高检测的灵敏度，加快检测进度，缓解产前孕妇的心理压力，目前在临床产前检验中的应用越来越广泛［3-9］。目前临床常用的非整倍体QFPCR试剂盒主要针对常见的13、18、21、X及Y染色体，通过分别设计引物，可同时检测多个STR位点，测算染色体上基因位点的拷贝数。但检测中应用PCR检测STR位点，对于低比例数目异常嵌合体的检测仍存在一定局限性，易造成漏诊［10-12］。我们抽取1例胎儿唐氏筛查（以下简称唐筛）18三体高风险的孕妇产前羊水细胞，采用QF-PCR法多个非整倍体试剂盒及X染色体STRs位点检测试剂盒检测STRs基因拷贝数，并分析其染色体核型，旨在为嵌合体的遗传学分析及产前诊断提供更多的数据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者，女，34岁，因胎儿唐筛18三体高风险于2020年10月就诊于我院产前诊断中心。孕21+1周，就诊时无发热、腹痛、阴道流血、流水等症状；否认家族遗传病史及不良生育史。本研究通过了珠海市妇幼保健院医学伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》要求。

1.2 孕妇羊水细胞X染色体STRs相关点位基因拷贝数检测 ①DNA抽提：取500μL羊水于EP管，5 000 rpm/min离心5 min，弃上清，沉淀中加入生理盐水1 mL，颠倒混匀后，5 000 rpm/min离心5 min，弃上清，在沉淀中加入8%chelex 10 060μL、10 mg/L的蛋白酶K 5μL，振荡混匀，56℃温浴2 h。100℃变性10 min，13 000 rpm/min离心10 min，取上清作为DNA模板备用。②染色体非整倍体QF-PCR检测：采用达瑞非整倍体检测试剂盒（广州达瑞生物，LOT：202002）检测X染色体STR18三体综合征相关位点拷贝数。取羊水DNA 2μL作为模板。按说明书配置扩增体系（10μL），在ABI9700基因扩增仪上进行STR扩增。循环条件：95℃5 min；95℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，共25个循环；72℃10 min，4℃60 min。扩增结束后在ABI3500DX遗传分析仪（美国ABI公司）进行毛细管电泳，结果用GeneMapper ID-X 1.0软件（美国ABI公司）GeneMapper ID-X 1.0软件（美国ABI公司）。③采用Devyser紧凑型V3试剂盒（瑞典，LOT：19I144）检测X染色体上7个性别染色体STR位点，评估X染色体上遗传信息拷贝数。取羊水DNA 1μL作为模板。按说明书配置扩增体系（10μL），在ABI9700基因扩增仪上进行STRs扩增。循环条件：95℃15 min；94℃30 s，58℃90 s，72℃190 s，共27个循环；72℃30 min；4℃。扩增结束后在ABI3500DX遗传分析仪（美国ABI公司）进行毛细管电泳，结果用GeneMapper IDX 1.0软件（美国ABI公司）GeneMapper ID-X 1.0软件（美国ABI公司）。④采用AGCU 19X-STR多重荧光复合扩增试剂盒（无锡中德美联，LOT：2007073）对19X-STRs进行扩增，分析X染色体STRs位点信息。取羊水DNA 1μL作为模板。按AGCU 19XSTR多重荧光复合扩增试剂盒说明书配置扩增体系，并编制扩增程序。扩增在ABI9700基因扩增仪上（美国ABI公司）进行，扩增后用ABI3500DX遗传分析仪（美国ABI公司）进行毛细管电泳，GeneMapper ID-X 1.0软件（美国ABI公司）。

1.3 孕妇羊水细胞染色体核型分析 取无菌操作采集的羊水细胞，5 000 r/min离心8 min，弃上清，将沉淀接种至装有5 mL羊水细胞培养基（广州和能生物，LOT：AF20191101）的培养瓶，37℃、5%二氧化碳培养箱培养7～8 d，待发亮细胞生长至5～6个克隆时，换液再培养24 h，加入秋水仙素0.25μg/mL，处理45 min，收集培养细胞，经低渗、固定、滴片、G带染色，获取羊水细胞染色体核型。每份标本制备A、B两线染色体利用染色体分析系统进行中期细胞核型分析。两名临床医师分A、B双线分析同一标本，每线计数15个核型，分析3个形态好的染色体核型，嵌合型加倍计数，参见ISCN（2016版）进行核型分析诊断［13］。

2 结果

2.1 X染色体STRs相关点位基因拷贝数 达瑞生物非整倍体检测试剂盒检测结果为，X染色体上C4区SRY的STR位点，没有扩增产物，说明样本为女性，C1、C2、C3、C5 X染色体STR位点均为单峰，C6所在Xq13区STR位点出现1个不平衡双峰，说明Z染色体上Xq13区带基因可能存在2个拷贝，其他区域基因仅有1个拷贝（图1）。

图1 本例孕妇产前羊水细胞X染色体Xq13区域C2、C3、C5、C6位点基因拷贝情况

Devyser紧凑型V3试剂盒检测结果为，羊水细胞X染色体上5个性别染色体STRs位点（XY1、XY2、X1、X3、X9）均为单峰，2个X染色体与常染色体STRs位点T1、T3位点上峰高之比为1：1和1：2。说明羊水细胞在X染色体上Xq13区域上基因有2个拷贝，在T3所在Xq21.1区域上，基因仅有1个拷贝（图2）。

图2 本例孕妇产前羊水细胞X染色体XY1、XY2、X1、X3、X9等位点基因拷贝情况

无锡中德美联AGCU 19X-STR多重荧光复合扩增试剂盒检测结果为，在X染色体上DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等5个位点上有不平衡双峰，而其余14个X-STRs位点均为单峰（图3）。

图3 本例孕妇产前羊水细胞X染色体DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等位点基因拷贝情况

2.2 羊水细胞染色体核型分析结果 共计数100个羊水细胞染色体核型，其中46，Xn，+mar占33组，45，X占67组。最终羊水细胞核型分析为：46，Xn，+mar［33］/45，X［67］，为嵌合型核型。羊水细胞染色体核型分析结果见图4。

图4 本例孕妇羊水细胞染色体核型分析结果

3 讨论

QF-PCR法通过对染色体上的标记STR遗传位点进行扩增，将同源染色体上两条等位基因的荧光峰高或峰面积的计算来量化染色体携带遗传物质的数量。每一个正常的二倍体样本与之相对应的则是体细胞染色体上的等位基因。根据国际公认的判断标准（欧盟ACC/CMGS），Devyser紧凑型V3试剂盒（瑞典）采用在人群中具有高度的异质性和多态性的STR基因座，设计了7个性别染色体STR位点来评估X染色体上遗传信息的拷贝数。该试剂盒检测到本例羊水标本的5个性别染色体STRs为单峰，未能提供X染色体上STR拷贝数的有效信息，2个X染色体与常染色体STRs位点T1、T3位点上峰高之比为1∶1和1∶2，提示该羊水细胞在T1所在Xq13区域上基因有2个拷贝，在T3所在Xq21.1区域上，基因仅有1个拷贝。在达瑞生物非整倍体检测试剂盒检测结果中，C4所在SRY的检测STR位点没有扩增产物，说明为一女性标本，C1、C2、C3、C5 4个X-STR位点均为单峰，C6所在Xq13的STR位点，有1个不平衡双峰出现，提示在Xq13区带上的基因可能存在2个拷贝，其他区域基因仅有1个拷贝。为寻找更多X染色体上STRs位点信息，我们利用无锡中德美联AGCU 19X-STR多重荧光复合扩增试剂盒检测，结果在DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等5个位点上有不平衡双峰，而其余14个X-STRs位点均为单峰，我们推测，在此5个STR所分布的着丝粒和Xq12区域上，基因有2个拷贝，而之外的区域，基因仅有1个拷贝。进一步羊水细胞培养后染色体核型分析发现，该羊水标本细胞核型为46，X，+mar［33］/45，X［67］，为嵌合型核型，因此结合STRs检测结果我们最终推论，该羊水细胞丢失一条X染色体，此条染色体仅残留着丝粒至q13区域，形成46，X，+mar与45，X两种核型的嵌合，因而大部分X-STRs为单峰，而在着丝粒至Xq13区域的STRs有双峰出现。

与传统核型分析方法比较，QF-PCR法检测STRs具有周期短、准确率高等优点［14］。但根据STR检测原理，其对染色体数目异常嵌合体和染色体结构的异常不敏感，常检测不到异常位点，容易导致漏诊，在仅一个或两个位点异常时，应考虑低比例数目异常嵌合的存在，此时应寻求更多STRs位点的信息综合评估嵌合体存在的可能。传统的染色体核型分析是目前诊断染色体病的金标准，对染色体异常具有最直接、准确的判断，是指导临床遗传咨询的依据之一［15-17］，借助传统的细胞核型分析，可明确嵌合体的诊断及嵌合比例。

在临床检测中，结合STR位点分析与染色体核型分析，可为嵌合体核型提供更多的遗传数据作为遗传学分析的证据［18-21］。

此案例中45，X核型占67%，X染色体残留mar核型占33%，QF检测X染色体区域出现1个位点可疑双峰，此时染色体微阵列检测可能出现X染色体信号减弱、或者信号难以判断的情况，为此可利用其他检测方法以寻求更多遗传学信息。AGCU 19XSTR多重荧光复合扩增试剂盒是检测X染色体上STR位点的检测系统，可判断X染色体上基因的拷贝数。本研究中，45，X为主要羊水细胞染色体核型，低比例核型有不明来源的片段。QF出现单个X位点两个拷贝的可疑信号，因此，我们选择AGCU 19X-STR多重荧光复合扩增试剂盒对此样本X染色体STR位点进行检测分析，发现Xq13区域的STRs有双峰信号，说明此区域基因有两个拷贝。综合分析推断，一条X染色体残留片段可能以mar形式存在，因而出现46，X，+mar［33］/45，X［67］的核型表现，而QF、STRs检测部分区域基因出现两个拷贝的双峰型，此标本的各项遗传学检测结果可相互解释映证。

综上所述，唐筛18三体高风险孕妇产前羊水细胞X染色体部分缺失，丝粒至q13区域保存，羊水细胞染色体核型为46，X，+mar［33］/45，X［67］，胎儿为嵌合体。QF-PCR法检测STRs联合传统核型分析可对嵌合型染色体数目异常提供诊断支持，为临床产前诊断提供支持。