马伟科，杨卫国，林燕鸿，张蕾，魏锋

1深圳市儿童医院重症医学科，广东深圳 518038；2深圳市儿童医院消化内科

脓毒症是感染引起的全身反应综合征，为全球儿童发病、病死的主要原因，全球每年有超过120万例儿童患脓毒症［1］。肝损伤是脓毒症的常见并发症，是病情进展为多器官功能障碍的早期临床表现之一，患儿病死率高达60%［2］。因此，早期对患儿进行预后评估具有重要意义。研究［3］表明，炎症反应、肠道细菌/内毒素移位与脓毒症并发肝损伤（sepsisassociated liver injure，SALI）的发生发展密切相关。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类内源性非编码小RNA，可调控细胞多种生物学功能，在肝脏疾病的发生发展中发挥重要作用［4］。miR-122a是特异性高表达于肝脏组织的一种miRNA。miR-122a参与了炎症反应，与多种肝脏疾病有关［5］。高迁移率 族 蛋 白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一类高度保守蛋白质，是启动和维持炎症瀑式反应的中心分子，可促进多种炎性介质的生成和释放［6］。miR-122a、HMGB1是否可用于SALI患儿的预后评估目前暂无相关报道。我们检测了SALI患 儿 血 清miR-122a、HMGB1，探 讨miR-122a、HMGB1在SALI患儿预后评估中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取深圳市儿童医院儿童重症监护室2018年7月－2020年5月间收治的脓毒症患儿198例，根据是否合并肝损伤分为两组，肝损伤组80例，其中男44例，女36例；年龄2～12岁，中位8岁；BMI 13～17 kg/m2，中位14 kg/m2。根据TBIL或ALT较正常水平升高程度［8］评估SALI组肝损伤程度，重度为TBIL升高＞3倍或ALT升高＞5倍，中度为TBIL升高2～3倍或ALT升高3～5倍，轻度为TBIL升高1倍或ALT升高1～2倍。根据肝损伤程度将肝损伤组分为重度37例、中度23例、轻度20例。无肝损伤组118例，其中男68例，女50例；年龄1～12岁，中位7岁；BMI 13～17 kg/m2，中位15 kg/m2。纳入标准：①脓毒症符合《儿童脓毒性休克（感染性休克）诊治专家共识（2015版）》［7］诊断标准；②肝损伤符合《国际儿科败血症共识会议：小儿败血症和器官功能障碍的定义》［8］诊断标准：血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）＞34.1μmol/L或丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）＞80 U/L；③患儿家属或监护人对研究知情同意；④临床资料完整者；⑤年龄1～12岁；排除标准：①药物、中毒等导致的肝损伤者；②既往存在肝脏疾病病史；③自身免疫性疾病者；④恶性肿瘤者；⑤肝炎病毒感染者。另选取同期60例体检健康儿童为对照组，其中男24例，女36例；年龄3～12岁，中位7岁；BMI 13～17 kg/m2，中位14 kg/m2；三组年龄、性别比例等一般资料具有可比性（P均＞0.05）。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 各组血清miR-122a、HMGB1检测 采集肝损伤组和无肝损伤组入院后次日清晨，对照组入院当日6 mL空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min，半径8 cm，分离血清，置于-80℃冰箱中待检。取3 mL，TRIzol试剂盒（北京百奥森泰生物技术有限公司）提取血清总RNA，TakaRa逆转录试剂盒（北京拜尔迪生物技术有限公司）转录合成互补DNA，加入miR-122a引物序列（正向引物：5'-GGGAAGTGGATACGAAGAATGC-3'，反 向 引 物：5'-CGACTTTAACACAGCGTGGAG-3'），实时荧光定量法检测，反应条件：95℃15 s、65℃20 s、75℃15 s，循环40次，以U6做内参校正（正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反 向 引 物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'），反应结束后得到各反应管Ct，以2-ΔΔCt代表miR-122a的相对表达量。另取3 mL，ELISA法（北京方程生物科技有限公司）测定血清HMGB1，所有操作均严格按使用说明书进行。重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件进行数据处理。计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验；等级资料间比较采用Z检验；正态分布且方差齐计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较q检验；偏态分布或方差不齐计量资料以M（QL，QU）表示，两组间Z检验，多组间H检验，组间两两比较Bonferroni法校正；对肝损伤组患儿随访28 d，以PICU时间、肝损伤程度（重度=3；中度=2；轻度=1）、miR-122a、HMGB1为自变量，预后情况为因变量（死亡=1，存活=0），采用多因素Logistics回归分析法分析SALI患儿不良预后的影响因素；绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析血清miR-122a表达、HMGB1水平对SALI患儿不良预后的预测价值，曲线下面积（area under curve，AUC）的比较采用Z检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组及不同肝损伤程度的SALI患儿血清miR-122a表达、HMGB1水平比较 肝损伤组、无肝损伤组、对照组血清miR-122a相对表达量分别为2.85±0.56、2.61±0.45及1.01±0.12，血清HMGB1水平分别为29.33（25.50，35.40）、20.45（16.20，24.64）及14.65（11.59，17.60）μg/L。与对照组比较，肝损伤组血清miR-122a相对表达量、HMGB1水平均升高，与无肝损伤组、对照组比较，肝损伤组血清miR-122a表达、HMGB1水平均升高（P均＜0.05）。

重、中、轻度SALI患儿血清miR-122a相对表达量分别为3.29±0.37、2.74±0.30及2.17±0.28，血 清HMGB1水 平 分 别 为35.58（31.65，39.41）、27.88（27.24，30.45）、22.15（23.90，24.79）μg/L。与轻度组比较，中度组血清miR-122a表达、HMGB1水平高（P均＜0.05），与中、轻度组比较，重度组血清miR-122a表达、HMGB1水平高（P均＜0.05）。

2.2 SALI患儿不良预后的影响因素 SALI患儿死亡48例、存活32例，死亡者男28例、20女例，年龄8（6，10）岁，BMI 15（13，16）kg/m2，PICU时间10.5（5，12）d，机械通气时间2.5（2，4）d，心率（116.65±6.96）次／分，感染部位为呼吸系统10例、消化系统12例、泌尿系统16例、中枢神经系统9例及其他1例，肝损伤程度为重度28例、中度11例、轻度9例，血清miR-122a相对表达量为3.19±0.40，血清HMGB水平为133.62（29.79，38.44）μg/L。存活者男16例、女16例，年龄8（5，9）岁，BMI 14（13，15）kg/m2，PICU时间5（3，11）d，机械通气时间3（1，4）d，心率（115.44±4.61）次／分，感染部位为呼吸系统7例、消化系统7例、泌尿系统12例、中枢神经系统4例及其他2例，肝损伤程度为重度9例、中度12例、轻度11例，血清miR-122a相对表达量为2.35±0.37，血清HMGB1水平为24.71（22.96，27.22）μg/L。二者PICU时间、肝损伤程度和血清miR-122a相对表达量、HMGB1水平差异具有统计学意义（P均＜0.05）。重度肝损伤、miR-122a、HMGB1为SALI患儿不良预后独立危险因素（P＜0.05）。SALI患儿不良预后的Logistics回归分析结果见表1。

表1 SALI患儿不良预后影响因素的Logistics回归分析结果

2.3 血清miR-122a表达、HMGB1水平对SALI患儿不良预后的预测价值 当截断值是0.490时，血清miR-122a表达预测SALI患儿不良预后的AUC为0.793，敏感度77.08%，特异度71.87%。当截断值是27.88μg/L时，血清HMGB1水平预测SALI患儿不良预后的AUC为0.788，敏感度64.58%，特异度78.12%，当截断值是0.46时，血清miR-122a+HMGB1预测SALI患儿不良预后的AUC为0.921，敏感度87.50%，特异度81.25%。血清miR-122a+HMGB1联合预测SALI患儿不良预后的AUC大于miR-122a、HMGB1（Z=4.093、3.623，P均＜0.05），敏感度、特异度也高于血清miR-122a、HMGB1单独预测。

3 讨论

肝脏是人体具有解毒、代谢、免疫等重要功能的器官，同时也是机体最大的网状内皮系统，是脓毒症早期易侵及损伤的器官之一［9-10］。肝损伤是脓毒症患者病情发展进入多器官功能障碍综合征的重要标志，其重要性高于中枢神经、循环、呼吸系统等预警指标，因此早期评估患者的预后极为重要。脓毒症发生后，肝脏可介导免疫反应清除细菌和内毒素，但同时也会引起肝脏炎症反应、免疫抑制，最终引起肝脏损伤；同时，肠道作为机体最大的细菌/内毒素储存地，随着内毒素产生量增加，可破坏肠黏膜，进入血液，再经血液进入肝脏，超过肝脏自身处理能力，加重肝损伤程度［3］。

miRNAs是一类内源基因编码长度为20～24个核苷酸的RNA分子，其家族成员主要存在动植物细胞核、细胞外及血液循环中，可互补配对mRNA碱基序列，结合靶miRNA的3’-非翻译区，抑制靶miRNA翻译在转录后水平调控基因的表达，参与了细胞多种生命过程［11］。miR-122a是肝脏特异性高表达miRNA，占总肝脏miRNAs的70%，参与调控肝细胞分化、增殖、凋亡等众多生物学过程［12］。目前研究证实，miR-122a还具有调控肝炎病毒复制、脂质代谢等功能，在miR-122a在肝细胞癌、纤维化、脂肪性肝炎等肝脏疾病中发挥作用。RAHMEL等［13］研究显示，脓毒症患者血清miR-122表达明显上调，与患者器官功能障碍发生和预后相关。而miR-122a作为miR-122家族一员，是否也与脓毒症患者器官功能障碍有关？研究发现，miR-122a可通过抑制B淋巴细胞瘤-2、B淋巴细胞瘤-XL表达，诱导淋巴细胞凋亡，抑制机体免疫功能［14］。本研究结果显示，对照组、无肝损伤组、肝损伤组血清miR-122a相对表达量逐渐提升，提示miR-122a可能参与了SALI发生。进一步分析显示，血清miR-122a相对表达量随着肝损伤加重而提升，为SALI患儿不良预后独立危险因素，分析与miR-122a可抑制机体免疫功能、增强细菌和内毒素介导炎症反应有关。闭合蛋白是一种跨膜紧密连接蛋白，过低或过度表达均会引起紧密连接屏障功能障碍。肠道中肿瘤坏死因子-α介导的闭合蛋白表达主要由miR-122a调节，提示miR-122a可能通过上调闭合蛋白的表达，引起肠屏障功能障碍，促进肠道细菌/内毒素移位，加重肝损伤，导致患儿预后不良［15］。

HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，广泛分布于心、肝、肾、肺、脑、淋巴等组织中，在进化过程中高度保守，在细胞核中具有调节转录、复制、DNA修复、核小体形成等作用，对维持细胞稳态功能具有重要作用［16］。HMGB1可通过被动释放或主动分泌从细胞核进入细胞质或细胞外，从而调节细胞组织应激反应，并结合Toll样受体2、Toll样受体4、晚期糖基化终末产物等相应胞膜受体，参与炎症反应［17］。LEE等［18］对小鼠注射重组HMGB1，发现实验小鼠出现脓毒症表现，再次注射姜酮靶向抑制HMGB1表达，小鼠体内组织损伤和总死亡率明显降低，说明HMGB1参与了脓毒症发生。YANG等［19］研究发现，HMGB1过度表达与肝细胞死亡程度呈正相关，参与急性肝衰竭的全身炎症和多器官衰竭，说明HMGB1参与了肝损伤。本研究结果显示，对照组、无肝损伤组、肝损伤组血清HMGB1水平逐渐提升，提示HMGB1可能参与了SALI发生。进一步分析显示，血清HMGB1水平随着肝损伤加重而提升，为SALI患儿不良预后独立危险因素，分析可能原因为胞外HMGB1可通过结合晚期糖基化终末产物受体，磷酸化促分裂原活化蛋白激酶，引起活化蛋白-1和核因子-κB核内转移，启动炎症的级联反应［20］。同时过度HMGB1表达介导的炎症反应还可提升肠道黏膜通透性，促进肠道细菌/内毒素移位［21］。

进一步分析SALI患儿不良预后的危险因素后发现，死亡及存活患儿的PICU时间、肝损伤程度和血清miR-122a、HMGB1水平差异明显。重度肝损伤、miR-122a、HMGB1为SALI患儿不良预后独立危险因素。重度肝损伤说明患儿病情严重，因此患儿的预后更差。

血清miR-122a表达、预测SALI患儿不良预后的AUC、敏感度、特异度为0.793、77.08%、71.87%，血清HMGB1水平分别为0.788、64.58%、78.12%，说明miR-122a与HMGB1均对SALI患儿不良预后具有一定预测价值，但二者联合检测的AUC明显增加，且敏感度、特异度更高，说明联合检测血清miR-122a、HMGB1水平更有利于评估SALI患儿不良预后。

综上所述，随肝损伤严重程度升高，脓毒症患儿血清miR-122a表达、HMGB1水平升高。SALI患儿不良预后的独立危险因素为重度肝损伤、血清miR-122a及HMGB1水平升高。血清miR-122a表达、HMGB1水平联合检测可用于预测SALI患儿的不良预后。