杨露银，杨忠明

1西南医科大学，四川泸州 646000；2西南医科大学附属中医医院肿瘤科

宫颈癌（Cervical Cancer，CC）是女性常见恶性肿瘤之一。流行病学数据表明CC在全球女性癌症中的发病率及病死率均较高，且呈年轻化趋势［1］。因CC临床表现缺乏特异性，多数患者就诊时病情已处于晚期，导致临床总体疗效不高。放化疗治疗常导致CC患者出现不良反应，使得患者治疗的依从性较差。寻求包括中医药在内的综合CC治疗方案是目前的研究热点。六君子汤出自《医学正传》，由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏六味药组成，主治脾胃气虚兼痰湿证。六君子汤具良好的抗肿瘤作用，基础实验证实其能抑制癌细胞增殖、促进凋亡，抑制肿瘤细胞迁移和血管生成，调节免疫功能及改善患者恶病质等；临床研究［2］数据亦表明该方能减轻放化疗不良反应、提升肿瘤患者的免疫功能等［2］。但目前六君子汤治疗CC的药理学作用及其机制尚不完全明确，仍需进一步研究。2020年8月—2021年1月，我们采取网络药理学的方法，筛选六君子汤治疗CC的主要活性成分及其关键靶点基因，分析六君子汤主要活性成分关键靶点基因的生物学功能，以期为六君子汤治疗CC的药物临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 六君子汤治疗CC的主要活性成分分析 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索六君子汤中人参、白术、茯苓、陈皮、半夏、甘草的化学成分，依据ADME原则，筛选出OB值（Oral Bioavailability）≥30%，DL值≥0.18的活性成分。

1.2 六君子汤治疗CC的关键靶点基因筛选

1.2.1 六君子汤主要活性成分作用靶点基因筛选 将筛选出的活性成为在DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）数据库中匹配相关药物作用靶点基因，并运用Uniport（https：//www.uniprot.org/）数据库对获取的药物作用靶点名称进行校正。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查询所获取的活性成分的2D分子结构式并保存；将获取的2D分子结构式导入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以 预测活性成分的作用靶点基因，以Probability≥0.3为标准最终得到六君子汤活性成分的作用靶点基因。

1.2.2 CC的疾病相关作用靶点基因筛选 在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）数据库及OMIM（https：//omim.org/）数据库中以“cervical cancer”、“cervical carcinoma”为检索对象进行检索，获取CC的治疗的相关靶点，并汇总、去重。由于疾病靶点信息较多，故依据score得分筛选出中位数，并选取score得分在中位数前的靶点信息作为疾病靶点。将获取的疾病靶点导入Uniprot中，选定范围为“Homo sapiens”，将靶点信息转化为对应的Uniprot ID及基因名称，最终得到CC的疾病相关作用靶点基因。

1.2.3 六君子汤治疗CC的关键靶点基因筛选 治疗CC的六君子汤主要活性成分作用靶点基因和CC疾病相关作用靶点基因导入Venny2.1.0在线工具（https：//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index.html）进行韦恩图绘制，获取共同靶点。将获取的共同靶点信息上传至string数据平台（https：//string-db.org）进行网络拓扑分析，设定高置信度为0.9，并隐藏无关联节点后得到六君子汤主要活性成分作用靶点基因与CC疾病相关作用靶点基因的PPI网络。将获取的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理，使用cytoHubba插件及Net-workAnalyzer进行网络分析，筛选度值（degree）前30的靶点为六君子汤治疗CC的核心靶点。

1.3 六君子汤主要活性成分关键靶点基因的生物学功能 运用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，分析六君子汤治疗CC的关键靶点基因的生物学功能。GO富集结果包括生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component）及分子功能（molecular function，MF）三个方面，依据P-Value、count及Fold Enrichment等指标筛选出排名前10的结果进行富集；KEGG富集分析时，筛选P≤0.05的通路进行富集，并使用R语言绘制富集气泡图。将获取的六君子汤主要活性成分、关键作用靶点基因及信号通路导入Cytoscape3.7.2软件，绘制六君子汤主要活性成分—关键靶点基因—信号通路图，进一步明确靶点进与信号通路在六君子汤治疗CC中的作用。

2 结果

2.1 六君子汤治疗CC主要活性成分 六君子汤治疗CC的主要活性成分有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β谷甾醇、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、黄芩素、芒柄花黄素、川陈皮素、苜蓿素等149个。

2.2 六君子汤治疗CC的关键靶点基因 六君子汤前6位活性成分的药物的作用靶点基因有促分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信号转导及转录激活蛋白（STAT3）、MAPK1、MAPK3、JUN、SRC、MAPK14、NR3CI、RELA、AKT1、TP53等331个。CC治疗相关靶点有3 300个。将331个药物活性成分作用靶点基因与3 300个疾病（CC）靶点合并、取交集，并进行维恩分析，得到222个药物—疾病共同靶点。最终筛选出六君子汤治疗CC的关键靶点基因有MAPK3、MAPK1、STAT3等30个。

2.3 六君子汤主要活性成分关键靶点基因的生物学功能 六君子汤治疗CC关键靶点基因涉及BP条目99个、细胞组成条目13个、MF条目21个。六君子汤治疗CC关键靶点基因主要参与的生物学功能为RNA转录、DNA链的特异性结合、细胞周期及细胞凋亡等，六君子汤治疗CC关键靶点基因主要富集在肿瘤相关信号通路、癌症中的蛋白多糖、ErbB信号通路等108条信号通路。六君子汤治疗CC的主要活性成分—靶点基因—通路网络关系图见图1。

图1 六君子汤治疗CC的主要活性成分—靶点基因—信号通路网络关系图

3 讨论

目前临床CC的治疗方法以手术及放化疗为主。随中医药在肿瘤治疗领域中的应用不断扩宽，越来越多的证据表明中医药能增效减毒，提高肿瘤患者生存质量、延长生存期。六君子汤作为临床应用十分广泛的经方之一，具有良好的抗肿瘤、增强免疫功能、改善恶病质、减轻放化疗不良反应等作用。本研究通过网络药理学研究方法，通过对六君子汤的活性成分、作用靶点基因的筛选，构建成分—靶点网络，分析其生物过程与信号通路，从而推测六君子汤治疗CC的作用机制。

通过网络药理学方法，初步筛选出六君子汤治疗CC的活性成分主要有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、芒柄花黄素、川陈皮素、苜蓿素等。槲皮素（Quercetin）主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡发挥抗肿瘤作用，可以通过灭活caspase/Cyto-c途径、抑制AP-2β/h TERT、抑制NF-κB/COX-2和阻断Akt/ERK1/2信号通路而发挥抗肿瘤作用［3］。山奈酚（Kaempferol）能抑制ERK/MAPK通路和PI3K-AKT通路诱导肿瘤细胞凋亡，还能诱导细胞周期阻滞，抑制癌细胞黏附、迁移与侵袭等方式发挥其抗肿瘤活性［4］。柚皮素（Naringenin）可以通过诱导ROS的产生，促进JNK磷酸化从而激活JNK/Bcl2信号通路，继而诱导CC细胞凋亡，抑制CC细胞的生长［5］。β-谷甾醇（beta-sitosterol）能通过介导AMPK、PTEN和HSP90发挥抗肿瘤作用，豆甾醇（Stigmasterol）能下调FOS、MYC、RAS、Bcl-2等多种癌基因和上调NF-2为代表的抑癌基因和Map2k6的表达；除此之外，还能增加G0/G1期细胞比例、降低G2/M期细胞比例，上调Bax蛋白、P53基因等促凋亡基因的表达，激活促凋亡蛋白caspase-8、caspase-9的表达，并通过损伤细胞DNA的方式，诱导肿瘤细胞凋亡［6-7］。

黄芩素（Baicalein）具有多途径、多靶点及多层次抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管新生、逆转肿瘤细胞化疗抗药性、抑制肿瘤侵袭和转移等效应［8-9］。芒柄花黄素（Formononetin）可以通过Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白调节多种信号通路诱导细胞凋亡，还能在体外和体内通过调节细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1等介质诱导抗肿瘤特性细胞周期阻滞，通过激活STAT、PI3K/AKT及MAPK信号通路抑制细胞增殖，通过调节VEGF、FGF2、MMP-2和MMP-9等达到抗肿瘤作用［10］。

川陈皮素（Nobiletin）主要通过抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，调节癌细胞周期和蛋白表达以及与化疗药物的联合以增强抗肿瘤作用［11］。苜蓿素（Medicarpin）能通过下调Bcl-2和上调Bax蛋白诱导细胞凋亡，同时能降低内皮细胞上ROS的生成从而下调VEGFR2信号传导，还能通过抑制肿瘤细胞中HIF-1积聚来降低VEGF的表达［12］。通过上述分析可以得知，六君子汤多种活性成分均有抗肿瘤活性，能从肿瘤细胞增殖、迁移及细胞周期等方面发挥抗肿瘤作用。

六君子汤治疗CC的关键作用靶点基因包括STAT3、MAPK家族相关蛋白、JUN等。SATA3作为信号蛋白，能参与多种和肿瘤形成相关的信号通路，在多种恶性肿瘤中呈高表达，能抑制细胞凋亡，促进细胞异常增殖从而加速肿瘤细胞的增殖和转移，在其与宫颈上皮内病变和CC组织表达的研究中，也提示STAT3的过表达与CC的发生发展有较为密切的关系［13］。MAPK家族相关蛋白作为蛋白激酶，在多种信号通路中充当信号转导成分，能调控细胞周期，促进血管内皮细胞增殖和新血管生成，从而加速肿瘤的生长，促进癌细胞的扩散［14］。JUN在细胞中常以亮氨酸拉链结构域的异源二聚体AP-1的形式存在，可因结构改变而被激活为癌基因。JUN的过表达可以导致AP-1的活化，进而调控下游靶基因促进转移瘤新生血管形成，导致肿瘤细胞增强和黏附分子的异常表达，从而促进肿瘤转移、侵袭［15］。这表明六君子汤可能通过抑制上述靶点基因的表达从而对CC产生治疗作用。

KEGG通路富集结果表明，六君子汤治疗CC可能与癌症相关信号通路、ErbB信号通路、催乳素信号通路、HIF-1信号通路及MAPK信号通路等有关。在癌症相关通路中，包括Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路、Jak-STAT信号通路及MAPK信号通路等经典信号通路均参与其中。Wnt通路的异常调控可能导致CC的发生［16］。PI3K/Akt通路是细胞生长、增殖和存续的一个关键信号。有证据表明这一途径还可发出促进细胞死亡信号，尤其是促进细胞坏死的信号［17］。在PI3K/Akt通路与CC的关系的研究［18-19］中发现，BMX能通过PI3K/Akt和STAT3信号通路促进细胞增殖和CC细胞的形成，而FOX-C1能直接靶向激活PI3K/Akt通路从而促进CC细胞存活、增殖和上皮—间质转化。

Akt信号通路作为HPVE6、E7癌基因蛋白的下游靶点，是CC发展的主要介质。JAK-STAT是与细胞凋亡有关的传导通路。研究［20］表明，JAK-STAT通路的活化与多种肿瘤的发生有密切联系，通过调节JAK-STAT通路能有效抑制Hela细胞的增殖。MAPK通路是细胞增殖、应激、炎症、分化、功能同步化、转化、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一，能把细胞外的信号传递到细胞内，从而参与细胞增殖、分化、癌变、转移、凋亡等多种生物过程。由此可推测，六君子汤的多种活性成分能够通过多种肿瘤相关通路对CC产生治疗作用。

综上所述，六君子汤治疗CC的活性成分主要有槲皮素、山奈酚、柚皮素等149个。六君子汤活性成分与宫颈癌治疗的共同靶点222个。六君子汤可能通过STAT3、MAPK家族相关蛋白、JUN蛋白等靶点，调控JAK-STAT、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路及MAPK信号通路，作用于RNA转录、DNA链的特异性结合、细胞凋亡等过程。