沈旭晨，蔡培泉*，糜祖煌，王春新，赵 琪

1南京医科大学附属无锡人民医院呼吸与危重症医学科，江苏 无锡 214023；2无锡市克隆遗传技术研究所，江苏 无锡 214026；3南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科，江苏 无锡 214023

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）通常存在于上呼吸道及肠道，是常见的条件致病菌。在近年的医院细菌耐药监测中，KP 检出率居第2 位［1-2］。高毒力型肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）合并多重耐药在国内已有多次报道［3-5］，甚至新生儿也常有感染耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的报道［6］。KP对各种年龄段人群造成威胁，使临床治疗面临艰巨挑战。尽管目前国内外有大量hvKP 的研究报道［7-9］，但是缺乏肺炎克雷伯菌肺炎患者KP 分离株的毒力基因分布与临床特征相关性研究。本研究选定了与KP 主要毒力因子菌毛、荚膜、铁载体密切相关的fimH、mrkD、wabG、uge、ureA、entB、clbA、ybtA 这8 种毒力基因进行检测，并分析其与患者临床特征的相关性，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象

选取2019 年8—9 月南京医科大学附属无锡人民医院住院患者各种临床标本中分离出KP 菌株的50 例肺部感染患者作为研究对象。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定与药敏分析

细菌鉴定与药敏分析采用法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动细菌鉴定及药敏分析仪。

1.2.2 靶基因检测

细菌DNA 提取采用非离子去污剂Triton X-100裂解加蛋白酶K 消化法。菌株先作纯培养，然后挑取单个菌落置入已预混好的Triton X-100 与蛋白酶K 溶液中，55 ℃温浴120 min，再95 ℃温浴10 min。-20 ℃保存待检。

PCR 检测毒力基因。每种毒力基因检测PCR扩增的反应系统均为：耐热DNA聚合酶（TaKaRa 公司，日本）1 U（0.2 μL），耐热DNA聚合酶匹配的10×缓冲液2 μL；P1 引物2 μL（1.0 μmol/L），P2 引物2 μL（1.0 μmol/L），dNTPs 2 μL（各种浓度均2 mmol/L），超纯水7 μL，菌株DNA 提取液4.8 μL，合计总反应体积20 μL，引物序列见表1。PCR检测扩增热循环为：95 ℃预变性3 min，然后95 ℃变性0.5 min，55 ℃复性0.5 min，72 ℃延伸1.0 min，30 个循环，最后一轮延伸72 ℃延长至5 min。经2%琼脂糖凝胶电泳20 min，紫外线仪下凝胶上出现与阳性对照分子量相同的条带即判别为阳性。

表1 8种靶毒力基因PCR扩增引物序列

1.2.3 临床特征分析

回顾性分析菌株来源患者的临床资料，包括性别、年龄、科室分布、住院时间、菌株来源、基础疾病、临床症状、侵入性操作、肺炎严重指数（PSI）评分、预后情况、耐药情况，并根据毒力基因检测结果进行分组比较。

2 结果

2.1 患者临床资料

KP菌株来自50例肺部感染患者，其中男36例，女14例。年龄分布在1～4岁及33～103岁，平均年龄（63.72±19.49）岁，60岁以上的老年患者占72%。标本来源为痰液48 份，血液1 份，肺泡灌洗液1 份。29 例社区获得性感染，21例医院获得性感染。总住院时间分布在5～185 d，平均为（31.86±37.27）d。患有乳腺癌、肺癌、食管癌等肿瘤疾病7 例，糖尿病9 例。34例进行气管内插管，19例进行深静脉置管，18 例留置尿管，23 例留置胃管。根据药敏结果，40%分离株为多重耐药菌株。抗菌药物耐药率分别为碳青霉烯类14%，青霉素类+酶抑制剂12%～40%，三代头孢10%～38%，四代头孢24%，氨基糖苷类8%～18%，喹诺酮类36%，超广谱β内酰胺酶阳性率30%。患者所在科室中，呼吸科、ICU患者共占50%，各外科及其余内科占比均在10%以下（图1）。

图1 50例肺炎克雷伯菌肺炎患者的临床科室分布

26 例因感染相关症状（如咳嗽咳痰发热等）入院，19 例因其他主诉入院。病程中，37 例（74%）出现咳嗽、咳痰，29 例（58%）出现发热，27 例（54%）出现胸闷、气短。

2.2 靶基因检测阳性率及电泳图

本研究分离自肺炎患者的50 株KP 菌株对fimH、mrkD、wabG、uge、ureA、entB、ybtA、clbA这8种毒力基因进行检测，其中wabG、uge、clbA 基因未检出，fimH、mrkD、ureA、entB、ybtA 均有检出（表2）。同时检测出2 种及以上毒力基因的菌株占100%，3种及以上占98%，4种及以上92%，5种及以上56%。

表2 50株肺炎克雷伯菌8种靶基因检测的阳性率

2.3 毒力基因分布与临床特征比较

如表3 所示，根据毒力基因检测阳性的结果进行分组比较，共计6 组，在各组内分别计算各比例。fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 组合例数达28 例，明显多于其余各组。比较发现，携带fimH基因分组的患者更常出现咳嗽咳痰、胸闷气短的症状。fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA组合的患者临床表现（咳嗽咳痰、胸闷气短）明显，但病死率并不高，仅14.29%。携带mrkD+ureA+entB 及fimH+mrkD+ureA+entB 组合的患者病死率高，同时多重耐药菌比例也较高。

50 例患者总体病死率为20%。将患者根据毒力基因阳性的数目分为4组，分析显示，随着毒力基因种类数目的增加，检测出3种、4种、5 种毒力基因阳性患者的病死率分别为33.33%、27.78%、14.29%，呈现下降趋势（表4）。

表4 毒力基因种类与临床特征 ［n（%）］

3 讨论

KP 作为条件致病菌，易导致危重症和免疫缺陷患者的肺部感染、泌尿道感染、血流感染、肝脓肿等［7］，hvKP甚至引起眼内炎、脑膜炎，导致患者的高致死率、高致残率。近年来KP感染率显著提高［10］。本研究中fimH、mrkD、ureA、entB、ybtA 基因均有不同程度的检出，clbA、wabG、uge基因未检出。

将患者根据检测毒力基因阳性的情况进行分组，性别、年龄、科室分布、住院时间、菌株来源等基础情况未见明显差异，但患者以中老年人为主要群体。34%菌株来自进行气管内插管的患者，符合既往研究机械通气是KP 感染的高危因素的结论［11-13］。26%菌株来自ICU，24%来自呼吸科，与相关文献报道ICU、呼吸科易检出KP［14］的结果一致。fimH、mrkD、entB、ureA 均高表达，阳性率＞85%，提示这些基因可能是KP 引起感染所必备的。咳嗽、咳痰为最主要表现（74%），其次为发热（58%）、胸闷气短（54%）。

所检测的基因组合中，fimH+mrkD+ureA+entB、fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 组合患者出现咳嗽咳痰、胸闷气短症状的比例高于mrkD+ureA+entB、mrkD+ureA+entB+ybtA 组合，且住院天数更长。fimH 基因编码的FimH 是Ⅰ型菌毛尖端的黏附素，能与宿主细胞表面含甘露醇的糖蛋白特异性结合，使细菌黏附在气道上皮，通过TLR4/NF-κB 途径诱导巨噬细胞分泌白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-6，产生炎症刺激［15-16］，使患者受刺激后产生咳嗽，气道分泌更多痰液，具有fimH 基因的菌株更易使患者出现咳嗽咳痰。

fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 组合为本次研究最常见的组合，咳嗽、咳痰症状比例较高，病死率较低，PSI 评分均值为Ⅲ级。随着毒力基因种类的增多，其表达的各种毒力因子也增多，使得患者临床症状增多并且明显。但毒力基因的种类增加，并未引起病死率的增加，毒力基因之间可能会相互影响，毒力基因种类增多引起各基因表达下降，导致其相应的毒力因子表达下降，病死率下降。既往研究发现免疫抑制状态的患者更易感染经典型肺炎克雷伯菌（cKP），免疫功能正常的患者更易感染hvKP［11］。随着毒力基因种类增多，各组检出例数增加，患有肿瘤及糖尿病的比例却降低了；毒力基因种类较少的菌株更易感染肿瘤及糖尿病患者，病死率更高。毒力基因种类的数目、相互作用及其与hvKP的产生之间的关系仍待进一步探讨。

具有较少种类毒力基因的组合患者常出现发热，本研究中检出率在95%以上的mrkD、ureA、entB基因在这一过程中也许具有较重要作用，特别是entB 基因。铁离子对细菌和宿主都是至关重要的，当宿主处于炎症反应中时，患者吸收铁能力减弱，因此通过铁调素减少细胞内的铁离子外流，使得患者体内的铁稳态出现异常，引起贫血并且免疫力减弱［16］。entB 作为铁载体肠杆菌素相关基因，能够帮助菌株竞争性结合血清中的游离铁，增强菌株毒性。同时，铁代谢与炎症反应的关系较为复杂，但近年来的研究发现，调节全身铁稳态重要因子的铁调素对于炎症的反应极为剧烈，而强烈的炎症反应常引起发热。

mrkD+ureA+entB、mrkD+ureA+entB+ybtA 组合患者PSI 评分均值都达到Ⅳ级，入住ICU 比例最高。mrkD+ureA+entB 组合在各组合中病死率最高（50%），以发热为共有特征，有侵入性操作史。mrkD+ureA+entB+ybtA 组合出现咳嗽咳痰、胸闷气短、发热等症状的比例较低，病死率为0%。mrkD+ureA+entB 组合均为医院获得性感染，mrkD+ureA+entB+ybtA 组合增加了ybtA 基因，以社区获得性感染为主。相似的是，fimH+mrkD+ureA+entB 组合与fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 组合相比，后者毒力基因多了ybtA，社区感染比例更高。由此可知，ybt 基因可能与社区获得性肺炎相关。

以往认为细菌会为了获得耐药基因而丢弃一些毒力基因［17］，以获得更好的适应性，但是本次研究中检测出带有3 种、4 种、5 种毒力基因的菌株其多重耐药比例分别为33.33%、33.33%、42.86%，随着毒力基因数目的增加，多重耐药比例也呈上升趋势。这提示所选取菌株中很可能存在高毒力高耐药的“超级细菌”。死亡患者感染菌株检出的毒力基因组合分别为mrkD+ureA+entB、fimH+mrkD+ureA+entB、fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA，临床需对带有这些毒力基因组合的菌株提高警惕。

综上所述，KP 容易引起老年群体的肺部感染，特别是合并肿瘤或糖尿病的群体，当这些易患人群感染带有毒力基因并多重耐药的菌株，抗感染治疗变得困难，可导致呼吸衰竭、全身多脏器衰竭等严重并发症，即使采取呼吸机辅助呼吸，但患者的基础肺功能差，最后有可能脱机困难，总体预后欠佳。在本研究中患者总体病死率达20%，1 例罹患肺间质纤维化而行右肺移植术后患者，所感染的KP分离株检出基因为fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA，且药敏结果为多重耐药菌，予以气管内插管，反复调整抗感染治疗方案，最终在住院111 d 后好转出院。因此，携带多种毒力基因的多重耐药KP 引起的感染对患者和医院都提出了很大挑战，建议临床科室尤其是ICU、呼吸科注重病原学检测及耐药机制的研究，密切关注患者病原菌感染情况，并加强院感监控。对于重症肺炎患者，感染、凝血及免疫功能相关指标均与病情和预后密切相关，需及早进行监测，帮助改善患者预后［18］。本研究在国内首次就肺炎克雷伯菌肺炎患者分离株进行了fimH、mrkD、wabG、uge、ureA、entB、ybtA、clbA 等8 种毒力基因检测，且对其分布及临床特征的相关性进行分析，为国内同行提供了基础数据作为参考。由于本研究的样本量较小，此次研究中wabG、uge、clbA基因均未检出，且mrkD+ureA、fimH+mrkD+ureA 组合毒力基因检测阳性的人数偏少，关于毒力基因与临床症状的进一步对应关系仍需要进行更多的研究。