肖 逸，王胜婵，王易欣，臧松松，张 炜

1南京医科大学第一附属医院泌尿外科，江苏 南京 210029；2南京医科大学附属逸夫医院泌尿外科，江苏 南京 211100；3 南京医科大学附属老年医院泌尿外科，江苏 南京 210024；4 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理系，江苏 南京211166

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）是一种具有强烈神经毒性的苯丙胺类兴奋剂［1］。研究表明，METH的神经毒性与小胶质细胞的激活有关［2］。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）中最重要的免疫细胞，正常情况下，小胶质细胞处于静息状态，而受到有害刺激后，小胶质细胞被激活，释放出肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症因子［3］。小胶质细胞发生持续的激活，可导致其周边神经组织的炎症损伤。Toll样受体（Toll like receptor，TLR）在小胶质细胞中广泛表达，该受体家族激活后作用于下游炎性信号分子，促使编码炎症的相关分子及细胞因子的基因转录［4-5］。然而，TLR是否参与METH引起的神经炎性反应尚不清楚。

本研究通过建立原代小胶质细胞METH染毒模型，旨在探讨TLR及其下游炎性信号及因子介导的炎性反应，从而为METH的干预提供潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

METH（中国食品药品检定研究院，纯度：99.9%），PrimeScriptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒（TaKaRa 公司，日本），小鼠IBA-1 单克隆抗体（Proteintech 公司，美国），小鼠Phospho-NF-κB p65（Ser536）单克隆抗体、兔NF-κB p65（D14E12）单克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国），HRP标记的羊抗兔IgG（H+L）及HRP 标记的羊抗小鼠IgG（H+L）（Jackson Immuno 公司，美国），磷酸酶抑制剂（Roche 公司，瑞士），细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、小鼠β-actin 单克隆抗体（Sigma 公司，美国），PVDF膜、ECL发光液（Millipore公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 原代小胶质细胞培养

孕18 d SD大鼠（购买于南京医科大学实验动物中心），麻醉后断头，无菌条件下取出腹中胎鼠，分离出两侧的大脑半球皮质，去除脑膜后置于HBSS液，胰酶消化后依次经100 μm 和40 μm 网筛过滤，将3×107个细胞接种于含18 mL DMEM 培养液（内含10%胎牛血清、1%双抗、0.04 mg/mL 巨噬细胞集落刺激因子）的75 cm2培养瓶中，接种4 d 后半量更换培养液，以后每隔3 d 换1 次培养液。本研究南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会批准（批准号：IACUC-1801008）。

1.2.2 免疫荧光染色

4%多聚甲醛固定原代小胶质细胞30 min，1%的Triton X-100 冰上透化5 min，10%山羊血清37 ℃封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃避光孵育2 h，加入含防荧光淬灭液的DAPI复染，激光共聚焦显微镜下扫描。所有结果至少重复3次。

1.2.3 蛋白免疫印迹实验

用蛋白裂解液（内含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂）裂解原代小胶质细胞，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度。电泳（浓缩胶电泳40 V，分离胶电泳90 V），转膜（200 V，1 h），封闭（5%脱脂奶粉溶液，2 h），一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，将PVDF膜与ECL发光液A液和B液（1∶1）混合，置于化学发光成像系统进行曝光。所有结果至少重复3次。

1.2.4 Real-time PCR

提取原代小胶质细胞的mRNA 后，按照Prime-ScriptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒说明书，将mRNA 逆转录成cDNA，设计引物（引物序列见表1），冰上配制反应体系，设置ABI7300荧光定量PCR仪反应程序（两步法）：96 ℃30 s 预变性，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40次循环。每个样品4个复孔，利用熔解曲线确定PCR产物是否单一，根据标准曲线得出扩增效率。以β-actin作内参，用2-ΔΔCT法对结果进行计算和分析。ΔΔCT=（CT1-CT2）-（CT3-CT4），CT1：处理样品待测基因的临界循环数，CT2：处理样品管家基因的临界循环数，CT3：对照样品待测基因的临界循环数，CT4：对照样品管家基因的临界循环数，所有结果至少重复3次。

表1 大鼠源引物序列Table 1 Sequence of rat derived primers

1.3 统计学方法

利用SPSS20.0 软件对实验结果进行统计学分析，各组数据用均数±标准差（）表示，多组定量资料比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，多组间数据两两比较用Dunnettt检验，两组定量数据比较用Student’st检验，用Graphpad Prism5 软件进行作图。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小胶质细胞的鉴定与纯度分析

小胶质细胞培养至第10～14 天，在恒温水平摇床上37 ℃，260 r/min 摇晃2 h，收集悬浮细胞，放入CO2恒温培养箱培养2～3 d后，利用免疫荧光方法对原代培养细胞进行鉴定与纯度分析。如图1 所示，红色荧光显示的是IBA-1阳性细胞，IBA-1是小胶质细胞的特异性激活标志蛋白，主要分布于细胞体。DAPI 染核，显示蓝色荧光。Merge 为两者的合并图。小胶质细胞的纯度=IBA-1阳性细胞/DAPI核染细胞×100%。随机计数10个视野下的IBA-1标记小胶质细胞数与DAPI 标记总细胞数，结果显示，按照本实验室分离培养小胶质细胞的方法，小胶质细胞纯度达到95%以上，符合后续实验要求。

图1 小胶质细胞的鉴定与纯度分析（×200）Figure 1 Microglial identification and purity analysis（×200）

2.2 METH对小胶质细胞的激活作用

为探究METH 对小胶质细胞的激活作用，用300 μmol/L 的METH 处理原代小胶质细胞15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h，观察原代小胶质特异性激活标志蛋白IBA-1的表达情况。如图2所示，IBA-1表达在METH处理30 min后开始上升，并在1 h达到高峰，差异有统计学意义（P＜0.05），提示METH明显激活原代小胶质细胞。

图2 METH对原代小胶质细胞的激活情况Figure 2 Activation of primary microglia induced by METH

2.3 METH对小胶质细胞炎性因子表达的影响

在300 μmol/L的METH分别处理原代小胶质细胞12 h、24 h 后，使用real-time PCR 检测炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的mRNA 表达。如图3 所示，TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA 在METH孵育24 h 后表达均显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01）。

图3 METH对小胶质细胞炎症因子表达的改变Figure 3 Effects of METH on the expression of inflammatory factors in microglia

2.4 METH 对小胶质细胞TLR 家族mRNA 水平的影响

文献报道，TLR 家族参与小胶质细胞的炎性反应作用。用300 μmol/L的METH与原代小胶质细胞孵育24 h，检测TLR 1～9、11的mRNA表达情况。结果显示，与对照组相比，METH 处理后TLR1 的mRNA在原代小胶质细胞表达下降，TLR2、4～5、7～9和11的mRNA表达均显著上升，差异具有统计学意义（图4），而TLR3 和TLR6 的mRNA 水平无明显变化。

图4 METH对原代小胶质细胞TLR1～9、11的mRNA水平的影响Figure 4 Effects of METH on mRNA expression of TLR 1-9 and TLR11

2.5 METH对NF-κB通路激活的影响

转录因子NF-κB 是TLR 信号的下游，参与调节炎性因子转录和表达［6］。300 μmol/L 的METH 处理原代小胶质细胞15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后，在15 min时NF-κB的磷酸化水平开始升高，在30 min 时达到高峰，与对照组比较，差异具有统计学意义，随后下降，但仍高于对照组（图5）。

图5 METH对NF-κB通路激活的影响Figure 5 Effects of METH on NF-κB activation

3 讨论

METH 属于苯丙胺类物质，是一种新型毒品。因为制造工艺简单，价格低廉，METH的滥用日益严重，给全世界带来严重的公共卫生问题［1］。动物和人群实验都显示，METH 滥用可导致严重的神经系统毒性［7-8］。METH的神经毒性作用机制十分复杂，主要包括兴奋性毒性、线粒体损伤、氧化应激、小胶质细胞炎症反应等［9］。目前，METH 诱导的小胶质细胞炎性反应是METH神经毒性的研究热点。小胶质细胞是中枢神经系统的主要炎性细胞，在保护大脑的完整性和维持大脑平衡中发挥重要作用。正常情况下，小胶质细胞处于静止状态，但当受到损伤或感染时，小胶质细胞被激活。持续激活的小胶质细胞会释放各种促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6，导致神经元细胞死亡［10］。本实验结果显示，原代小胶质细胞暴露在METH 30 min 后，IBA-1 蛋白的表达明显升高；处理24 h后，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的mRNA 水平明显升高，上述结果提示，METH 暴露明显激活小胶质细胞，且促进小胶质细胞中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 的高表达。然而，目前METH 诱导小胶质细胞炎症反应的机制并不完全明了。因而，本研究探讨METH 激活小胶质细胞可能的上游信号通路。

TLR 是模式识别受体，在生物体中广泛存在。哺乳动物中至少存在13个TLR基因，TLR1～9在小鼠和人类中均表达，而TLR10～13仅在小鼠中表达［11］。研究表明，TLR 在神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经干细胞中都有表达［12］。小胶质细胞表达多种TLR，该家族受体在小胶质细胞的免疫反应中发挥重要作用，是识别细菌或病毒感染的第一道防线，并促进各种炎症介质的产生。在静止的小胶质细胞中几乎无法检测到TLR的表达，但一旦小胶质细胞被激活，就会迅速表达多种TLR［11］。本实验中，通过real-time PCR 检测METH 激活的小胶质细胞内TLR 家族成员mRNA 的水平变化，我们发现TLR2～5、7～9、11 的mRNA 表达显著增加。提示小胶质细胞可能通过上调多种TLR来响应METH的刺激，TLR 表达的增加随后通过信号转导来上调炎性因子mRNA的表达。NF-κB作为炎性反应中的关键转录因子，在小胶质细胞激活导致的神经炎性的发生过程中发挥重要作用。因而，本研究探讨了参与TLR 诱导炎性因子表达的下游信号通路NF-κB的激活情况。在中枢神经系统中，NF-κB 信号通路可参与多种神经退行性疾病进程。一些研究表明，NF-κB的激活是促炎性细胞因子表达调控的关键步骤，活化后的NF-κB 转移到核内与其相关DNA 基序结合以诱导炎性因子基因的转录［13-14］。这些结果支持了本研究中METH暴露激活原代小胶质细胞内NF-κB的结果，提示NF-κB参与了TLR 诱导炎性因子的表达。

本研究揭示了TLR/NF-κB信号通路参与METH诱导的原代小胶质细胞的激活及其炎性因子表达的过程，后续将进一步对TLR/NF-κB信号通路之间的信号传递蛋白进行深入研究，以期为METH 神经毒性的干预提供潜在靶点。