张俊波，刘绍雄，华 蓉，李建英，尚陆娥，刘春丽，刘祈猛，罗孝坤，孙达锋，**

（1．中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省供销合作社科学研究所，云南 昆明 650221）

大球盖菇 （Stropharia rugosoannulata Farl．ex Murrill）隶属于担子菌门（Basidomycota）层菌纲（Hymenomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 球盖菇科（Strophariaceae） 球盖菇属（Stropharia）。别名皱环球盖故、酒红色球盖菇、皱球盖等，商品名为赤松茸[1－3]。

大球盖菇是一种营养丰富、口味鲜美、品质优良的珍稀食用菌，也是在抗肿瘤活性方面极具开发潜力的药用真菌[4]。近年来，由于食用菌产业快速发展，特别是棚室等保护地的集约化，以及工厂化食用菌产业的快速扩张，使大球盖菇发展相对滞后，大球盖菇的研究也相对薄弱，以至于一度成为小宗品种，只在部分省份局部栽培[1-6]。对大球盖菇研究包括化学成分研究、胞外酶研究、生物学特性、原生质体再生及单核化研究、栽培研究、加工方法研究、其他应用价值研究等[5]。

大球盖菇是生物分解农作物下脚料的能手，以谷物秸秆和粪肥为主要栽培料，栽培出菇的同时又解决了环境污染问题，成为生态农业的生力军[7]。大球盖菇产量高，生产成本低；营养丰富，易被消费者接受，同时又能有效消纳秸秆，减少面源污染、培肥地力、变废为宝、改善生态环境、增加农民收入。因此是精准扶贫、栽培结构调整、林业产业和矿区经济转型的示范项目，各地纷纷出台优惠扶持政策，促进了大球盖菇的迅速发展。目前大球盖菇除鲜品外，还有以腌渍品、干品为主流的产品，深加工研究也在不断深入，产品品类不断扩大，正处于蓬勃发展的关键时期[8-10]。

大球盖菇的栽培原材料丰富，玉米秸秆、麦秆、玉米芯、杂木屑等均可栽培；栽培技术简便粗放，生料栽培、发酵料栽培均可，技术门槛低，且容易获得成功和高产，栽培效益好；林下、套种、露天、棚栽均可，栽培模式多样，品种抗逆性强，适应温度范围广；生态效益好，社会效益突出，能有效促进产业融合[1-10]。

目前与大球盖菇相关的专利较多，其中大部分为培养基制备、培养料制备和栽培方法，其次为深加工类。从培养基、培养料、栽培，再到深加工的诸多专利不断的推进着大球盖菇产业的发展。

然而，目前市场上常售卖的大球盖菇为菌盖红褐色至葡萄酒红色，或暗褐色品种，且市场需求在逐年扩大。但品种单一制约其发展，消费者可选择品种较少[1-2，8-11]。本研究中培育的新品种，改善了大球盖菇品种单一的问题，能有力推动大球盖菇产业发展，推动食用菌产业的发展。随着大球盖菇产业的迅速发展，所选育的金黄色大球盖菇新品种，填补了市场品种空白，具有较高的研究价值。

金黄色大球盖菇品种，是由常规的酒红色大球盖菇在长期栽培过程中发生变异而产生，其菌盖颜色的改变且开伞后菌褶颜色较浅，属优良变异；所选育的新品种金黄色大球盖菇在“香、味”兼具的前提下，其最新的特点是颜色为金黄色，成为最突出的亮点具有极大市场优势[12]。大球盖菇已逐渐被市场所接受，研究所选育的金黄色大球盖菇将具有巨大的市场潜力。

1 试验方法

参照国家标准GB/T 21125-2007食用菌品种选育技术规范[13]对其进行选育。具体选育程序为对品种和野生种质资源收集→纯菌种分离→菌种培养→生理性能测定→初筛→复筛→区别性鉴定（形态、生理、同工酶、DNA指纹） →中间试验→示范栽培→优良品种。

按照上述常规育种的程序，对选育的大球盖菇菌株进行了生物学特性比较及驯化栽培研究。根据菌株菌丝体生长速度、长势等参数，结合拮抗试验、DNA比对分析，完成品种的室内初步鉴定；通过栽培驯化，品种比较试验，初步筛选出菌株编号为ZJJQG001的大球盖菇菌株。2019年～2021年在云南省昆明市晋宁区宝峰镇进行了初筛、复筛及中间试验，以四川省认定品种川审菌2004004大球盖菇1号（菌株由四川菇之源生物科技有限公司提供）为对照。

1.1 菌株筛选

2017年3月，选育组于云南省昆明市盘龙区双龙乡大球盖菇栽培基地发现金黄色大球盖菇变异子实体。通过PDA培养基分离获得金黄色大球盖菇菌株，其子实体形态特征见图1。在25℃恒温暗培养，比较生长速度、粗壮程度、浓密度等菌丝长势，最终筛选出菌丝长势最优菌株ZJJQG001。

图1 变异大球盖菇图片Fig.1 Picture of mutations Stropharia rugosoannulata

由图1可知，本研究菌株来源于酒红色大球盖菇自然变异子实体，通过自然变异子实体分离获得。酒红色大球盖菇子实体生长初期为浅白色，随着进一步的生长发育，菇盖颜色渐变为红褐色至暗褐色或葡萄酒红褐色。变异子实体与酒红色大球盖菇最大的区别为菌盖浅黄色至金黄色，其他特征与酒红色大球盖菇相同。

1.2 出菇试验

原种、栽培种配方：木屑40%、棉籽壳40%、麦麸13%、玉米粉5%、白糖1%、石膏1%，含水量约60%。

发酵料配方：木屑42%、谷壳30%、玉米芯20%、麦麸或米糠5%、石膏1%、石灰1%、过磷酸钙1%。

子实体阶段最适生长环境温度为15℃～26℃，因此在自然条件下可在春、秋两季栽培[1-3]，试验选择在秋季栽培。另可根据大球盖菇的生物学特性、当地气候和栽培设施等条件而定。其栽培场地选择接近水源、排灌方便、土壤肥沃、避风向阳、交通方便、背风、土质疏松、富含腐殖质、有机质含量高的场所[4-6]。

1.2.1 栽培方法

参照大球盖菇一般栽培程序“做床→铺料→播种→打孔→覆土→覆盖物→发菌管理→催菇→出菇管理→采收”进行出菇试验[5-7，9]。

1）做床

场地杀菌灭虫后，栽培料调节水份75%，发酵料温度降至25℃以下时开始铺料。床宽1.0 m～1.5 m，过道宽30 cm（南北走向为好）。辅料前床面撒一层石灰粉。

2） 铺料及播种

播种前，菌种外袋过石灰水（杀灭菌袋表面的杂菌），后脱袋播种。以3层料2层菌种的方式播种。第1层料约8 cm～10 cm，料层平整，厚度均匀。第2层菌种播种完成后，在上面铺第3层料，厚约3 cm，将菌种盖严。

3） 打孔

在料床侧面扎2排直径5 cm的孔洞至料床中心下部，呈“品”字形。孔间隔约20 cm。为菌丝生长提供充足氧气，防止料中心高温烧菌。

4） 覆土

播种后立即覆土，覆土厚度以3 cm～4 cm为好（早出菇覆土薄）。

5） 覆盖物

播种完成后，加盖覆盖物，如稻草、松针等，覆盖物要经过石灰水消毒。冬季覆膜增温、保湿。

6） 发菌管理

播种后2 d～3 d萌发，3 d～4 d开始吃料；播种早可防止高温烧菌，料温控制在20℃～30℃，不超过35℃；通常播种后20 d内不喷水或少喷水，根据料湿度情况而定；一般20 d后菌丝吃料达1/2以上时，加大菇床四周喷水，保持土壤水分和空气湿度。

7） 催菇

大约40 d～60 d菌丝吃透培养料，覆土层充满菌丝，菌丝束扭结增粗，即可进行催菇管理。喷一次催菇重水，加大通风，降低棚内温度15℃～20℃，刺激原基形成。

8） 出菇管理

大球盖菇由原基分化到子实体成熟一般需要5 d～8 d。保持温度14℃～25℃，空气相对湿度90%～95%，注意通风，保证空气新鲜。出菇期间水分管理较为重要，要坚持勤喷轻喷、菇多多喷、菇少少喷、晴天重喷、雨天少喷或不喷的原则。

9） 采收

菌盖外的一层菌膜刚破裂、菌盖内卷不开伞、菌盖呈钟形时为采收适宜期；采完一潮后，应及时补水，经过10 d～12 d开始出第二潮，可连续采三潮～四潮。

1.3 分子生物学试验

用CTAB法分别提取菌株ZJJQG001的菌丝及栽培出菇子实体的基因组DNA，并以1%的琼脂糖凝胶电泳后经GelRed染色后进行检测。

以提取到的总DNA为模板，采用Mix混合试剂（湖南擎科生物技术有限公司），以ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 和 ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’） 为引物扩增ITS（Internal Transcribed Spacer） 序列。PCR扩增体系为 （25 μL） 2 × Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1引物各 0.5 μL，ddH2O 11 μL，DNA 模板 0.5 μL。

反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，35个扩增循环；72℃延伸 10 min，4℃保藏；以1%的琼脂糖凝胶电泳后进行检测，送至擎科生物技术完成测序。

1.4 品种选育试验

1.4.1 小试初筛

大球盖菇按照1.2.1试验方法栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品种选育技术规范要求，小试初筛试验设计每组栽培面积为5 m2，3组重复，按每667平方米（有效播种面积500 m2）菌种播种量300 kg计算，每平方米播种量为0.6 kg，每组菌种播种量为3 kg。有效播种面积内发酵料5 000 kg，每平方米发酵料为10 kg，每组发酵料量为50 kg。产量测定为每组子实体总重量，子实体性状检测随机抽取30个子实体计算平均值。

1.4.2 小试复筛

大球盖菇1.2.1试验方法栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品种选育技术规范要求。小试复筛试验设计每组栽培面积为10 m2，3组重复，按每667平方米（有效播种面积500 m2）菌种播种量300 kg计算，每平方米播种量为0.6 kg，每组菌种播种量为6 kg。有效播种面积内发酵料5 000 kg，每平方米发酵料为10 kg，每组发酵料量为100 kg。

1.4.3 中间试验

大球盖菇按1.2.1试验方法栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品种选育技术规范要求。中间试验设计每组栽培面积为200 m2，按每667平方米（有效播种面积500 m2）菌种播种量300 kg计算，每平方米播种量为0.6 kg，菌种播种量为120 kg。有效播种面积内发酵料5 000 kg，每平方米发酵料为10 kg，每组发酵料量为2 000 kg。

产量测定采用五点法测产，每个样点1 m2，产量按有效面积500 m2计算。子实体性状随机抽取30个子实体计算平均值。

1.4.4 示范栽培

测产菌种最终在云南省昆明市晋宁区宝峰镇试验栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品种选育技术规范要求。示范栽培试验设计栽培面积为1 000 m2（3次重复，每次重复栽培面积约333.5 m2），按每667平方米（有效播种面积500 m2）菌种播种量300 kg。以大球盖菇1号菌种为对照。2个品种采用相同的菌种量（每667平方米菌种播种量300 kg） 和一致的示范栽培管理技术。

2 试验结果

2.1 菌丝生长情况

ZJJQG001菌株菌丝生长情况见图2。

图2 菌株ZJJQG001菌丝生长情况Fig.2 Mycelial growth of strain ZJJQG001

由图2可知，菌株ZJJQG001菌丝初期洁白、浓密、粗壮，生长较快，后期分泌色素，中央部分呈浅黄色。

分离得到的ZJJQG001纯菌株和大球盖菇1号菌株进行拮抗试验，结果见图3。

图3 拮抗试验Fig.3 Antagonism test

由图3结果显示，ZJJQG001纯菌株和大球盖菇1号菌株有较强的拮抗反应，不具有亲和性，形成“沟型”拮抗线。说明ZJJQG001纯菌株和大球盖菇1号菌株为2个不同品种菌株。

2.2 选育结果

2.2.1 分子鉴定

ZJJQG001菌株ITS系统发育分析结果见图4。

由图4可知，菌株ZJJQG001菌丝体ITS序列与S.rugosoannulata序列 （KC176328.1） 覆盖度达98%，相似度98.62%。其子实体ITS序列与S.rugosoannulata序列（KC176328.1） 覆盖度达98%，相似度98.06%。通过使用BLAST软件对大球盖菇1号和菌株ZJJQG001菌丝体ITS序列进行比对，两者有约1%差异。因此，确定菌株ZJJQG001为大球盖菇（S.rugosoannulata），将其品种定名为“中菌金球盖1号”。

图4 菌株ZJJQG001系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZJJQG001

2.2.2 小试初筛

菌株ZJJQG001小试初筛试验结果见表1。

表1 小试初筛出菇产量和性状统计Tab.1 Statistics of fruiting yield and traits in preliminary screening of small test

由表1可以看出，菌株ZJJQG001小试初筛试验组出菇状况良好，通过测产折算，结果表明第1组产量为6.45 kg·m-2，第 2组产量为6.90 kg·m-2，第 3组产量为 5.85 kg·m-2。3 组平均产量为 6.40 kg·m-2。试验结果较好，出菇整齐；菌盖为金黄色，直径8.4 cm；菌柄白色，长11.3 cm，直径5.4 cm，子实体平均单菇鲜重为46.8 g。平均优质菇率89%，说明该金黄色大球盖菇可以发展人工栽培。

2.2.3 小试复筛

菌株ZJJQG001小试复筛试验结果见表2。

表2 小试复筛出菇产量和性状统计Tab.2 Fruiting yield and characters statistics in secondary screening of small test

由表2可以看出，菌株ZJJQG001小试复筛试验出菇状况良好，第1组产量为5.85 kg·m-2，第2组产量为 6.45 kg·m-2，第 3 组产量为 6.22 kg·m-2。3组平均产量为6.17 kg·m-2。出菇状况较初筛更好，管理更成熟，优质菇有了明显提高，出菇整齐，菌盖为金黄色，直径7.3 cm，菌柄白色，直径4.7 cm，长10.2 cm，子实体平均单菇鲜重为59.2 g，平均优质菇率91%。

2.2.4 中试试验

菌株ZJJQG001中试试验子实体性状较好，出菇整齐，产量达6.79 kg·m-2，出菇整齐，菌盖为金黄色，直径5.3 cm，菌柄白色，直径3.9 cm，长8.1 cm，子实体单菇平均鲜重为61.6 g，优质菇率为92%。从初筛、复筛到中间试验，由于管理技术越来越成熟，产量稳定提高。说明菌株ZJJQG001出菇稳定性较好。

2.2.5 示范栽培

通过示范栽培，菌株ZJJQG001均一性和稳定性的调查分析结果见表3、表4。

表3 示范点菌株ZJJQG001产量Tab.3 Yield of strain ZJJQG001 in demonstration sites

由表3、表4可以看出，较对照的大球盖菇1号，ZJJQG001菌株子实体菌盖颜色为金黄色，无酒红色出现，整体出菇效果好，单菇肥厚，老后菌褶不易变黑，优质菇率较高。2019年～2020年供试菌株多点示范平均产量分别为 6.04 kg·m-2、6.18 kg·m-2、6.15 kg·m-2，产量较高。且制作干片不用削皮处理，带皮干片品质接近大球盖菇1号削皮干片。因此，ZJJQG001菌株可作为大球盖菇新品种，增加市场产品种类选择。

表4 示范点菌株ZJJQG001和大球盖菇1号主要农艺性状Tab.4 Main agronomic performance of strain ZJJQG001 at demonstration site

3 品种特异性、稳定性和一致性比较

中菌金球盖1号栽培品种形态见图5。

图5 大球盖菇新品种中菌金球盖1号Fig.5 The new Stropharia rugosoannulata cultivar Zhongjun Jinqiugai No.1

中菌金球盖1号为淡黄色至金黄色，大球盖菇1号为酒红色；大球盖菇1号菌褶颜色为深褐色。中菌金球盖1号，子实体丛生或单生，中等至较大。菌盖接近半球形，成熟后趋于扁平，直径一般为5 cm～25 cm，较大的可达30 cm。子实体生长初期菌盖为金黄色，后期为浅黄色，开伞后菌褶颜色为米黄色至浅灰色。菌褶密集排列且直生，初期白色，后期米黄色至浅灰色。适宜采收期，菌柄长度一般为8 cm～12 cm，菌柄直径一般为4 cm～7 cm，呈白色。通过观察出菇性状特征，中菌金球盖1号具备一致性。