刘 刚，崔朝初，卢 娜，冯超丽，刘 博，万光瑞，王现伟

(1.新乡医学院基础医学院，河南省医用组织再生重点实验室，河南 新乡 453003；2.新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种常见的慢性炎症性疾病，严重时可引起冠状动脉性心脏病、脑梗死和外周血管病，给患者及家属带来严重的不良影响[1-3]。AS的主要病理特征为血管壁脂质沉积和炎症细胞浸润，炎症反应可加剧AS斑块损害或破裂，从而增加心血管不良事件的发生[2,4]。AS的发病机制至今尚未完全阐明，随着研究的不断深入，近年来炎症免疫学说在AS发病中的作用得到了学术界的普遍重视[5-6]。有研究发现，特异性地抑制白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子可显著减少AS及其并发症的发生[7-9]。复方心脉佳是由功能性红曲米、葛根、牡丹皮等10余味中药和天然提取物组成，具有抗炎、抗氧化等功效，可逆转AS[10-13]。目前，关于复方心脉佳在AS中的确切抗炎机制尚不清楚。因此，本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和尼日利亚菌素(nigericin)刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和人单核巨噬细胞THP-1构建体外炎症细胞模型，探讨复方心脉佳对巨噬细胞炎症相关因子caspase-1和IL-1β表达的影响，旨在为复方心脉佳在临床AS治疗中的应用提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和人单核巨噬细胞THP-1购自中国科学院细胞库，液氮冷冻保存。

1.2 试剂与仪器复方心脉佳为本实验室自制(批号141206、150122、150214)[14]；LPS、尼日利亚菌素(nigericin)和拂波醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)购自美国Sigma公司，高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、RPMI 1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibico公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、放射免疫沉淀测定(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)蛋白酶抑制剂、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒和细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自北京索莱宝生物科技有限公司，TRIzol试剂购自美国Invirogen公司，反转录试剂盒和SYBR Green染料购自日本Takara公司，增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒、胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司，caspase-1抗体、IL-1β抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，山羊抗兔偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)二抗和山羊抗小鼠偶联HRP二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二氧化碳(carbon dio-xide,CO2)培养箱购自美国Eppendorf公司，酶标仪购自美国Molecular Devices公司，NanoDrop 2000超微量分光光度计购自美国Thermo公司，蛋白化学发光成像系统购自美国GE公司，实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)仪器购自美国Roche公司，电泳仪和电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞复苏及培养将液氮保存的RAW264.7细胞和THP-1细胞置于37 ℃水浴锅中至完全融化，取RAW264.7细胞接种于含体积分数10% FBS高糖DMEM，THP-1细胞接种于含体积分数10% FBS 1640培养基，置于37 ℃、含体积分数5% CO2饱和适度的培养箱中培养，每隔2 d更换1次培养基。待RAW264.7细胞长满培养皿底部面积80%时应用胰蛋白酶消化传代。THP-1细胞培养1周后1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，培养基重悬后传代。取对数生长期RAW264.7细胞和THP-1细胞用于后续实验。

1.3.2 复方心脉佳药物制备准确称量20 mg复方心脉佳粉末，37 ℃下溶于10 mL超纯水中，保温孵育10 min；取上清，过0.22 μm滤膜，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 CCK-8检测细胞存活率取对数生长期RAW264.7细胞，按每孔1×104个细胞接种至96孔板中，随机分为对照组和体积分数0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%复方心脉佳组，分别滴加体积分数0、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%和 20.0%的复方心脉佳，每组设置3个复孔，并设空白对照组，置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养24 h，更换新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK-8，置于培养箱中培养3 h；使用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率 =(复方心脉佳组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%。实验重复3次，取均值。当细胞存活率低于90%，认为该药物浓度对细胞具有毒性，取无细胞毒性的复方心脉佳浓度用于后续实验。

1.3.4 细胞分组及处理取对数生长期的RAW264.7细胞，均匀接种至6孔板中，将细胞分为对照组、LPS组、低剂量复方心脉佳组、中剂量复方心脉佳组和高剂量复方心脉佳组；对照组细胞未做任何药物处理，LPS组细胞应用1 mg·L-1LPS孵育4 h；低剂量复方心脉佳组、中剂量复方心脉佳组和高剂量复方心脉佳组细胞分别用体积分数 1.0%、2.5%、5.0%复方心脉佳孵育12 h，随后加入1 mg·L-1LPS孵育4 h。收集各组细胞，置于-80 ℃冰箱保存备用。取对数生长期THP-1细胞，均匀接种至6孔板中，加入100 μg·L-1PMA孵育48 h，将细胞随机分为对照组、联合刺激组、低剂量复方心脉佳组、中剂量复方心脉佳组和高剂量复方心脉佳组。对照组细胞未做任何药物处理；联合刺激组细胞给予1 mg·L-1LPS孵育4 h后，加入10 μmol·L-1nigericin孵育1 h；低剂量复方心脉佳组、中剂量复方心脉佳组和高剂量复方心脉佳组分别用体积分数1.0%、2.5%、5.0%复方心脉佳预孵育12 h后，加入1 mg·L-1LPS孵育4 h，然后加入10 μmol·L-1nigericin孵育1 h；收集等体积各组细胞培养上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.5 Western blot法检测RAW264.7细胞中IL-1β前体和caspase-1前体蛋白的表达取各组RAW264.7细胞，PBS冲洗3遍，每组加入 200 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1离心15 min，取上清，用BCA试剂盒进行蛋白定量；取20 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至聚偏氟乙烯膜，加入体积分数5%脱脂奶，室温孵育1 h，加入caspase-1抗体(11 000)、IL-1β抗体(11 000)和GAPDH抗体(11 000)4 ℃ 过夜孵育；洗膜后加入对应种属的HRP标记二抗(18 000)室温孵育1 h，滴加ECL发光液，暗室中曝光、显影，应用化学发光成像系统进行图像采集，Image J图像分析软件分析各条带灰度值，caspase-1和IL-1β相对表达量以目的蛋白灰度值与内参蛋白(GAPDH)灰度值的比值表示。实验重复3次，取均值。

1.3.6 qRT-PCR检测RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体和核转录因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)mRNA表达取对照组、LPS组和高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞，按照RNA提取试剂盒说明书，应用TRIzol法提取细胞中总RNA，NanoDrop分光光度计检测总RNA浓度和纯度，按照说明书步骤反转录总RNA，qRT-PCR法检测各组细胞中caspase-1前体、IL-1β前体和NF-κB mRNA的Ct值。反应程序为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共42个循环，以β-actin为内参。caspase-1前体上游引物序列为5′-ACAAGGCACGGGACCTATG-3′，下游引物序列为5′-TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG-3′；IL-1β前体上游引物序列为5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′，下游引物序列为5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′；NF-κB上游引物序列为5′-GGAGGCATGTTCGGTAGTGG-3′，下游引物序列为5′-CCCTGCGTTGGATTTCGTG-3′；β-actin上游引物序列为5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG- 3′，下游引物序列为5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。采用2-ΔΔCt法计算IL-1β前体、caspase-1前体和NF-κB mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.3.7 Western blot法检测THP-1细胞培养上清液中IL-1β和caspase-1蛋白的表达取各组THP-1细胞培养上清，置于EP管中，300×g离心5 min，取上清置于新的EP管中，加入质量分数2%脱氧胆酸钠，震荡混匀后加入质量分数100%三氯乙酸100 μL，4 ℃过夜沉淀；4 ℃下14 000 r·min-1离心15 min，弃上清，冰丙酮洗涤3次，14 000 r·min-1离心15 min，弃丙酮，加入上样缓冲液溶解蛋白，煮沸5 min后，取20 μg蛋白样品进行Western blot检测，方法同“1.3.5”项。

若继受取得说成立，依其定义必须从他人处通过让渡取得权利，这里所指的他人，只能是善意取得关系人中的原权利人或无权处分人，权利只能从原权利人或无权处分人处让渡。

2 结果

2.1 复方心脉佳对RAW264.7细胞活性的影响对照组与0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%复方心脉佳组的细胞存活率分别为(100.00±2.43)%、(102.25±2.76)%、(102.05±2.76)%、(100.63±3.32)%、(94.17±2.05)%、(83.62±3.46)%、(79.44±9.60)%。复方心脉佳体积分数低于5%时，细胞存活率>90%，对细胞无明显毒性。

2.2 5组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体蛋白相对表达量比较结果见图1和表1。对照组和LPS组RAW264.7细胞中caspase-1前体蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；低、中、高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体蛋白相对表达量显著低于对照组和LPS组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体蛋白相对表达量显著低于低、中剂量复方心脉佳组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体蛋白相对表达量显著低于低剂量复方心脉佳组，差异有统计学意义(P<0.05)。LPS组和低、中、高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中IL-1β前体蛋白相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；低、中、高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中IL-1β前体蛋白相对表达量显著低于LPS组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中IL-1β前体蛋白相对表达量显著低于低、中剂量复方心脉佳组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中IL-1β前体蛋白相对表达量显著低于低剂量复方心脉佳组，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：对照组；2：LPS组；3：低剂量复方心脉佳组；4：中剂量复方心脉佳组；5：高剂量复方心脉佳组。

表1 5组RAW264.7细胞中caspase-1前体和IL-1β前体蛋白相对表达量比较

2.3 3组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体和NF-κB mRNA相对表达量比较结果见表2。LPS组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β 前体以及NF-κB mRNA相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体以及NF-κB mRNA相对表达量显著低于LPS组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体和NF-κB mRNA相对表达量比较

2.4 5组THP-1细胞培养上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量比较结果见图2和表3。联合刺激组和低、中、高剂量复方心脉佳组THP-1细胞培养上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；低、中、高剂量复方心脉佳组THP-1细胞培养上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量显著低于联合刺激组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量复方心脉佳组THP-1细胞培养上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量显著低于低、中剂量复方心脉佳组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量复方心脉佳组与中剂量复方心脉佳组THP-1细胞培养上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1：对照组；2、3：联合刺激组；4：低剂量复方心脉佳组；5：中剂量复方心脉佳组；6：高剂量复方心脉佳组。

表3 5组THP-1细胞培养上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量比较

3 讨论

近年来，我国在心血管系统疾病的研究和防治中取得了巨大的进步，但心血管疾病发病率仍较高，其中因AS导致的死亡人数约占我国居民疾病死亡的40%，给社会和人民带来了沉重的经济负担[3]。最近的一项流行病学研究表明，2020年全球近20亿人患颈动脉粥样硬化，患病率呈逐年上升趋势[15]。因此，深入研究AS的发病机制和开发安全有效的治疗药物对于AS的防治至关重要。2017年，卡纳单抗抗血栓临床研究组(the canakinumab anti-inflammatory thrombosis outcomes study,CANTOS)首次发现，以IL-1β为靶点的卡纳单抗可显著减少因AS引起的相关不良心血管事件的发生率[7]，提出炎症因子IL-1β直接参与了AS的发展进程，这为AS炎症免疫假说提供了有力证据。因此，开发以IL-1β为靶点的药物或可成为未来预防和治疗AS新的突破。

复方心脉佳主要由功能性红曲米、葛根和牡丹皮等10余味中药和天然提取物构成，具有“急治血瘀、慢治脂瘀”的功效。研究显示，心脉佳可降低由过氧化氢引起的内皮细胞损伤，减少细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、IL-1等炎症因子表达，增加超氧化物歧化酶表达和一氧化氮水平[12]。另有动物实验研究显示，心脉佳可显著降低AS动物模型血液中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白以及ICAM-1和VCAM-1水平，显著减少颈动脉斑块面积，改善内皮细胞功能以及血流动力学指标[10,13,16]。这些研究结果说明，复方心脉佳可从抗氧化、抗炎、调节血脂等多个方面缓解AS的发展进程，但其具体的作用机制还不清楚。大量研究发现，AS斑块中除了含有脂质外，还存在着多种炎症细胞，特别是巨噬细胞[17-18]。巨噬细胞在受到LPS、nigericin和氧化低密度脂蛋白等活化剂的刺激下，可激活NF-κB信号通路，显著上调IL-1β前体和caspase-1前体等炎症相关因子表达；caspase-1前体可被切割成活化的caspase-1并促进成熟IL-1β等炎症因子的释放，最终导致巨噬细胞的脂质代谢紊乱，加重AS的发展[9,19-20]。因此，本研究以巨噬细胞RAW264.7作为研究对象，应用LPS刺激方法体外构建炎症细胞模型，观察复方心脉佳对RAW264.7细胞中caspase-1和IL-1β 表达的影响，从抗炎方面探讨复方心脉佳治疗AS的作用机制。

本研究结果显示，复方心脉佳干预RAW264.7细胞24 h后，当其浓度低于5.0%时，细胞存活率> 90%，说明复方心脉佳体积分数低于5.0%对细胞无明显毒性，故本研究采用体积分数1.0%、2.5%和5.0%作为药物的工作浓度用于后续实验研究。本研究结果显示，低、中、高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体蛋白相对表达量显著低于对照组和LPS组，LPS组和低、中、高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中IL-1β前体蛋白相对表达量显著高于对照组，低、中、高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中IL-1β前体蛋白相对表达量显著低于LPS组，高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体蛋白相对表达量显著低于低、中剂量复方心脉佳组，中剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体蛋白相对表达量显著低于低剂量复方心脉佳组。LPS组RAW264.7细胞中caspase-1前体、IL-1β前体mRNA相对表达量显著高于对照组；高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞caspase-1前体、IL-1β前体mRNA相对表达量显著低于LPS组和对照组。这一结果说明复方心脉佳可显著降低LPS诱导的IL-1β前体、caspase-1前体mRNA和蛋白表达水平，且呈剂量依赖，提示复方心脉佳可通过降低巨噬细胞中IL-1β前体、caspase-1前体mRNA和蛋白表达水平，抑制巨噬细胞导致的炎症反应，从而逆转已发生的AS。

有研究显示，LPS可激活巨噬细胞中NF-κB信号通路，增加IL-1β前体和caspase-1前体的转录水平[21]，因此推测，复方心脉佳可能通过调控NF-κB信号通路减少caspase-1和IL-1β mRNA的表达。本研究结果显示，LPS组RAW264.7细胞中NF-κB mRNA相对表达量显著高于对照组，高剂量复方心脉佳组RAW264.7细胞NF-κB mRNA相对表达量显著低于LPS组，证实复方心脉佳可降低LPS诱导的巨噬细胞NF-κB mRNA的表达，提示复方心脉佳可能是通过抑制NF-κB信号通路减少巨噬细胞中caspase-1和IL-1β水平。成熟的IL-1β可通过旁分泌或自分泌的方式释放至组织间隙或血液中发挥其重要的生物学效应，由于RAW264.7细胞存在缺陷无法产生和分泌成熟的IL-1β和caspase-1，因此，本研究进一步检测了复方心脉佳对巨噬细胞THP-1培养上清液中IL-1β和caspase-1蛋白表达水平的影响，结果显示，复方心脉佳可显著降低LPS和nigericin诱导的THP-1细胞培养上清液中IL-1β和caspase-1蛋白的表达，且呈剂量依赖性。这说明复方心脉佳还可以通过抑制巨噬细胞释放IL-1β和caspase-1来减轻炎症反应。

综述所述，复方心脉佳通过抑制巨噬细胞中NF-κB信号通路，抑制caspase-1前体和IL-1β前体的mRNA和蛋白表达，减少caspase-1和IL-1β的产生和释放，发挥防治AS的作用。但复方心脉佳治疗AS可能具有多靶点和多条调节途径，如抗氧化及脂质调节机制，本研究仅仅从该药的抗炎症反应机制做了研究，对于复方心脉佳治疗AS的具体机制还需进一步的研究。