刘恒道，吕风华，郭令利，刘宇宙，朱瑞芳，白雪洋,朱 鑫,孙云龙,石 琳，孟 哲

(1.郑州大学第一附属医院心血管内科，河南 郑州 450052；2.新乡医学院第一附属医院心血管内一科，河南 卫辉 453100；3.河南省直第三人民医院内分泌科，河南 郑州 450006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)的血管并发症尤其冠状动脉性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)是DM致死和致残的主要原因，严重危害人类健康[1]。二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)作为机体内一种酶类物质，在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)中发挥重要的血糖调节作用。研究发现，DPP4抑制剂可使动脉粥样硬化血管斑块面积减小，延缓DM和冠状动脉疾病患者颈动脉内膜中层厚度的进展[2-5]，而颈动脉内膜中层厚度是动脉粥样硬化的标志，提示DPP4可能直接参与DM血管并发症的发生、发展。体内蛋白质、核酸、脂质等大分子物质的氨基基团可与葡萄糖的醛基发生一系列反应生成晚期糖基化终末产物 (advanced glycation end products，AGEs)，AGEs通过直接作用或与糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)结合，介导一系列复杂的分子信号转导及调控机制，参与DM血管并发症的发病过程[6]。基于此，本研究通过检测DM并发CAHD患者血清DPP4水平，分析DPP4与AGEs以及心血管重要危险因素的相关性，探讨DPP4在DM并发CAHD中的作用；并通过体外实验，观察外源性DPP4对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中一氧化氮(nitric oxide，NO)和内皮型一氧化氮合酶Ser1177位点的磷酸化(phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase at Ser1177,peNOSSer1177)水平的影响，分析DPP4在内皮细胞损伤中的作用，为探讨DM并发CAHD的分子机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年9月至2019年9月郑州大学第一附属医院心血管内科收治的疑似DM或(和)CAHD 164例患者为研究对象，其中男84例，女80例；年龄28～78(59.43±9.01)岁。病例纳入标准：(1)根据临床症状、体征初步诊断DM或(和)CAHD；(2)年龄 18～80(60.12±8.69)岁；(3)患者或家属知情同意并签订知情同意书者。排除标准：(1)病史资料不完整患者；(2)存在严重的肝肾功能不全患者；(3)心功能Ⅳ级及急性肺水肿患者；(4)存在恶性肿瘤、急性感染性疾病、严重的造影剂过敏患者；(5)孕妇、哺乳期妇女；(6)无法合作及存在精神疾病患者等。根据确诊情况将患者分为DM组、CAHD组、DM+CAHD组和对照组，DM的诊断符合2017 年版《中国 2 型糖尿病防治指南》[7]诊断标准，CAHD的诊断符合《中国慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》[8]2007年版CAHD诊断标准，DM+CAHD组患者为同时符合DM和CAHD诊断标准，对照组患者为根据糖尿病诊断标准排除DM且根据冠状动脉造影排除CAHD的其他疾病患者。DM组41例，男21例，女20例；年龄23～79(56.90±11.12)岁。CAHD组43例，男22例，女21例；年龄25～77(61.71±9.25)岁。DM+CAHD组38例，男21例，女17例；年龄22～80(62.67±7.16)岁。对照组42例，男20例，女22例；年龄18～78(59.63±8.43)岁。4组患者年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 细胞、试剂及仪器HUVECs购自美国ATCC细胞库，人重组DPP4购自美国R&D公司，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国Gibco公司， peNOSSer1177抗体(9570S)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 抗体(9586S)购自美国Cell Signaling公司，山羊抗兔二抗购自中国爱博泰克生物有限公司，NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，AGEs酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测试剂盒购自美国CELL BIOLABS公司，DPP4 ELISA检测试剂盒购自美国Ebioscience公司，二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；全自动生物化学分析仪购自瑞士罗氏公司，生物安全柜购自香港力康公司，高速离心机购自德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 4组患者血压、血糖及血脂的检测(1)入院时测量患者收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)。(2)于入院第 2 天凌晨，抽取患者空腹肘静脉血 5 mL，采用全自动生物化学分析仪检测患者空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、餐后2小时血糖(2-hours postprandial blood glucose，2 h-PBG)及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)等指标。

1.3.2 4组患者血清AGEs及DPP4水平的测定血清采集参考文献[9]：所有研究对象均于清晨抽取空腹静脉血5 mL，静置1 h，800 r·min-1离心10 min，取上层血清，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA检测血清中AGEs及DPP4水平，严格按试剂盒说明书步骤进行操作。

1.3.3 HUVECs细胞培养及分组取冻存的HUVECs，恒温水浴锅中解冻后，800 r·min-1离心5 min，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM混匀，转移细胞悬液至 25 mL 细胞培养瓶，置于37 ℃、含体积分数5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天换液1次，至细胞融合至80%～90%时，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，按12进行分瓶、传代。传代后，待细胞融合率达到70%～80%时，取对数生长期细胞随机分为对照组、100 μg·L-1DPP4干预组、500 μg·L-1DPP4干预组，对照组细胞给予无血清的DMEM干预，100 μg·L-1DPP4干预组、500 μg·L-1DPP4干预组细胞分别给予100、500 μg·L-1DPP4干预，干预24 h后收集细胞用于后续实验。

1.3.4 硝酸还原酶法检测HUVECs上清液中NO水平取干预24 h的各组HUVECs细胞，1 000 r·min-1离心5 min，取上清液，采用硝酸还原酶法分别测定标准品(试剂盒中提供)及各组样品波长550 nm处吸光度值，计算NO水平，NO=(样品吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)×标准品浓度×样品测定前稀释倍数。实验重复3次，取均值。

1.3.5 Western blot检测HUVECs中peNOSSer1177相对表达量参考文献[10-11]报道的Western blot法检测HUVECs中peNOSSer1177相对表达量。具体方法：取干预24 h的各组HUVECs细胞，加入细胞裂解液冰上裂解，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，配制SDS-PAGE凝胶后，取25 μL细胞蛋白加至样品孔中，80 V电泳30 min后，120 V电泳至蛋白 Marker充分分离，290 mA 恒流下转膜90 min；脱脂奶粉封闭，滴加peNOSSer1177一抗(稀释度11 000)，4 ℃孵育过夜，TBS 洗涤 10 min×3 次，滴加山羊抗兔二抗(稀释度12 000)，避光室温孵育 1 h；TBS 洗涤 10 min×3 次，增强化学发光液滴加至聚偏二氟乙烯膜上，暗室中曝光、显影，化学发光凝胶成像系统拍照，Image J 图像处理系统分析条带灰度值，peNOSSer1177相对表达量以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 4组患者血压、血糖及血脂水平比较结果见表1。DM组患者SBP、FBG、2 h-PBG、TC显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；CAHD组患者SBP、LDL、TC显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；DM+CAHD组患者SBP、FBG、2 h-PBG、LDL、TC、TG水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；CAHD组患者SBP水平高于DM组，2 h-PBG水平低于DM组，差异均有统计学意义(P<0.05)；DM+CAHD组患者FBG、2 h-PBG、TG水平高于DM组和CAHD组，差异均有统计学意义(P<0.05)；其余组间相关指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 4组患者血压、血糖及血脂水平比较

2.2 4组患者血清中DPP4、AGEs水平比较及 DPP4与AGEs相关性分析结果见表2。DM组、CAHD组、DM+CAHD组患者血清DPP4、AGEs水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；DM+CAHD组患者血清DPP4、AGEs水平高于DM组和CAHD组，差异均有统计学意义(P<0.05)；DM组与CAHD组患者血清DPP4、AGEs水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。Person相关分析显示，4组患者血清DPP4水平均与AGEs呈正相关(r=0.459、0.768、0.731、0.541，P<0.05)。

表2 4组患者血清DPP4、AGEs水平比较

2.3 4组患者DPP4与血压、血糖及血脂水平相关性分析Person相关分析显示，对照组患者血清DPP4水平与LDL、HDL、TC、TG、FBG、2 h-PBG、SBP、DBP均无相关性(P>0.05)；DM组患者血清DPP4水平与LDL、TC、 FBG、2 h-PBG、SBP水平呈正相关(r=0.68、0.77、0.86、0.78、0.80，P<0.05)；CAHD组患者血清DPP4水平与LDL、TC、FBG、2 h-PBG、SBP水平呈正相关(r=0.78、0.60、0.91、0.50、0.79，P<0.05)；DM+CAHD组患者血清DPP4水平与LDL、TC、FBG、2 h-PBG、SBP水平呈正相关(r=0.52、0.51、0.83、0.70、0.83，P<0.05)。

2.4 3组HUVECs中NO水平和peNOSSer1177相对表达量比较对照组、100 μg·L-1DPP4干预组、500 μg·L-1DPP4干预组HUVECs中NO水平分别为(12.64±1.11)、(10.65±1.05)、(7.98±1.00)mmol·L-1，HUVECs 中 peNOSSer1177相对表达量分别为0.99±0.12、0.64±0.05、0.44±0.07；100 μg·L-1DPP4干预组和500 μg·L-1DPP4干预组HUVECs中NO水平和peNOSSer1177相对表达量低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；500 μg·L-1DPP4干预组HUVECs中NO水平和peNOSSer1177相对表达量低于100 μg·L-1DPP4干预组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

DM是21世纪全球面临的严重而危急的公共健康问题之一，世界卫生组织估计，未来在全球范围内高血糖将是导致过早死亡的第三大危险因素，仅次于高血压和吸烟。中华医学会糖尿病学分会指出，随着我国经济增长、人们生活方式的变化及人口老龄化，DM患病率显著增加，已成为严重威胁我国人民生命健康的重大卫生问题。在DM所有并发症中，血管并发症包括大血管病变和微血管病变是最常见的并发症，也是DM致死和致残的主要原因，其中与动脉粥样硬化相关的心血管疾病比例高达75%。有研究报道，DM是CAHD的独立危险因素，与非DM患者相比，DM患者发生CAHD的风险增加了2～4倍，而CAHD也是DM患者的常见死亡原因，说明DM合并CAHD更加严重地威胁着我国人民的生命健康[12]。因此，深入探讨DM并发CAHD的发生机制十分必要。

本研究结果显示，与对照组相比，DM患者SBP、FBG、2 h-PBG及TC水平显著升高；与单纯DM或者CAHD组患者相比，DM并发CAHD患者FBG、2 h-PBG、TG水平显著升高；说明DM患者往往合并其他代谢异常，而高血压、高脂血症、高血糖是DM患者并发CAHD的重要危险因素。AGEs既是高血糖的结果，又是心血管损伤的起始，其可通过直接或与其受体RAGE结合，介导一系列复杂的分子信号转导及调控机制，通过胰岛素抵抗、慢性炎症、氧化应激等机制参与DM血管并发症的发病过程[13]。本研究结果显示，DM组、CAHD组、DM+CAHD组患者血清AGEs水平高于对照组，DM+CAHD组血清AGEs水平高于DM组和CAHD组，DM组与CAHD组患者血清AGEs水平无明显差异，这与既往研究结果一致[14-15]，证实AGEs可促进DM患者血管病变的发生、发展，导致CAHD的发生,是DM并发CAHD的一个重要因素。

血管内皮细胞作为高糖损伤的重要靶点，其功能失常是DM患者血管病变的早期标志，也是DM患者合并心血管疾病的独立危险因素。高血糖状态下，血管舒张和收缩因子如内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、前列环素等分泌失衡，特别是NO生物活性降低，可导致内皮细胞功能障碍。既往研究证实，DPP4抑制剂作为一种广泛应用于临床的降糖药，可通过改善内皮细胞功能来抑制动脉粥样硬化的发生、发展[12,16]。推测其机制可能是DPP4抑制剂通过抑制DPP4发挥酶促作用，使其底物胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)/葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)水平升高，进一步通过激活环磷酸腺苷/一氧化氮合酶系统促进NO释放，抑制环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号转导减轻炎症反应，从而发挥血管保护作用[1,17]。有研究报道，DM并发CAHD患者血清DPP4水平升高与循环DPP4酶活性增加相关[18-19]。SCHLATTER等[19]和ISHIBASHI等[20]研究报道，AGEs可使血清中DPP4水平升高，在近端肾小管内皮细胞中，AGEs不仅上调了DPP4的表达，而且增加了可溶性DPP4的释放；ISHIBASHI等[20]在HUVECs模型中发现，AGEs与其受体结合诱导了活性氧水平的增加，通过促进基质金属蛋白酶切割DPP4胞外区域增加可溶性DPP4的生成。因此，推测DPP4酶活性增加可促进其底物如GLP-1和GIP的降解，发挥降糖作用，同时削弱GLP-1/GLP-1R信号通路对血管内皮的保护作用；循环中DPP4水平升高可能直接参与内皮功能损害，促进DM并发CAHD的发生发展。本研究结果显示，DM组、CAHD组、DM+CAHD组患者血清DPP4水平高于对照组；DM+CAHD组患者血清DPP4水平高于DM组和CAHD组；DM组与CAHD组患者血清DPP4水平比较无明显差异。进一步对DPP4与AGEs及血压、血糖、血脂等传统CAHD危险因素[21]进行相关性分析显示，4组患者血清DPP4均与AGEs呈正相关，DM组、CAHD组及DM+CAHD组患者血清DPP4水平与LDL、TC、FBG、2 h-PBG、SBP水平呈正相关，对照组患者血清DPP4水平与LDL、TC、 FBG、2 h-PBG、SBP水平无相关性。以上研究结果提示，血清DPP4在DM并发CAHD中发挥了血管损伤作用，并且与其他危险因素一起，共同促进血管损伤的发展。

随着对DPP4研究的深入，DPP4的非酶促作用被逐渐关注。研究表明，循环中的DPP4作为配体可以不依赖GLP-1/GIP的非酶促作用通过内皮细胞和平滑肌表面的蛋白酶激活受体2导致细胞增殖和炎症反应[18,22]，而炎症反应和平滑肌细胞增殖是CAHD发生、发展的重要过程。内皮细胞功能失常是CAHD的起始事件，NO是内皮细胞的重要活性因子，而内皮细胞peNOSSer1177是合成NO的关键酶。目前，关于DPP4是否可以直接导致NO活性降低以及机制如何尚不清楚。因此，本研究选择HUVECs进行体外DPP4干预，检测干预后HUVECs中 NO水平和peNOSSer1177相对表达量变化，结果显示，100 μg·L-1DPP4干预组和500 μg·L-1DPP4干预组HUVECs中NO水平和peNOSSer1177相对表达量显著低于对照组，500 μg·L-1DPP4干预组HUVECs中NO水平和peNOSSer1177相对表达量显著低于100 μg·L-1DPP4干预组。这一结果证实DPP4可通过非酶促作用直接导致内皮细胞功能障碍，其机制可能是DPP4通过抑制内皮细胞peNOSSer1177的表达降低NO的表达水平，导致内皮细胞发生炎症反应和损伤，且这种作用呈剂量依赖性。

综上所述， DM患者并发CAHD患者血清中DPP4和AGEs水平明显升高，二者呈正相关性，DPP4与DM、高脂血症、高血压等CAHD发生的重要危险因素相关，外源性DPP4直接导致内皮细胞功能失常，说明血清DPP4是DM患者并发CAHD的危险因素，这也为DPP4抑制剂血管保护作用的研究提供了新的理论支持。但本研究临床部分主要是横断面数据，无法提供因果关系的确切证据，因此，DPP4与DM患者CAHD发生、发展的关系仍需进一步研究。