李 鑫，洪 萌，侯铁奇

(1.新乡市中心医院眼科，河南 新乡 453000；2.河南大学第一附属医院眼科，河南 开封 475000；3.中山大学附属第三医院眼科中心，广东 广州 510630)

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是临床常见的疾病，多数患者发病与遗传因素有关，属于一种严重的、遗传性、致盲性疾病[1]。RP的遗传方式有常染色体隐性遗传(占50.0%～60.0%)、常染色体显性遗传(占30.0%～40.0%)和X性连锁遗传(占5.0%～15.0%)。RP以视网膜感光细胞及视网膜色素细胞的退行性变为病理改变，其主要临床表现为夜盲、管状视野，严重影响患者的健康及生活质量[2]。目前，RP的治疗方法主要包括药物治疗(如维生素A、神经营养因子、中药等)、视觉假体装置治疗等。这些治疗虽然能改善患者的临床症状，但是尚无证据表明何种疗法的疗效更为确切[3]。

干细胞是一类特殊细胞，具备多向分化潜能，干细胞移植为临床治疗视网膜变性病变提供了新的方法。干细胞移植方法主要包括局部移植和全身移植。局部移植能将干细胞直接植入病变部位，其作用靶点确切，细胞浓度较高；而全身移植主要通过静脉途径将干细胞输入到血液内，干细胞随血液循环到达损伤或病变的部位，从而达到治疗疾病的目的。有研究显示，骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)移植有助于延缓病情发展，减缓感光细胞的凋亡，调节内环境稳定[4]。此外，间充质干细胞具有神经营养、抑制炎症等生理特征，成为多种疾病治疗的重要细胞来源[5]。但是，尚未见有研究将BMSC用于大鼠RP的治疗。本研究旨在探讨大鼠BMSC的分离制备方法及其对RP大鼠视网膜的修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物47只8周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性24只，雄性23只，体质量230～270 (250±20) g，由河南大学医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2011-0004。大鼠常规饲养，温度(20.0±2.0)℃，湿度50%～60%，自由摄食(建立模型前12 h禁食)、饮水，每日光照12 h。本研究对大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》[6]的相关要求，并通过实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器速眠新注射液购自吉林省华牧动物保健品有限公司，盐酸奥布卡因滴眼液购自日本参天制药株式会社，小鼠抗人线粒体抗体购自美国Abcam公司，CD45、CD29及CD44抗体购自北京索莱宝科技有限公司，血清脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)酶联免疫吸附试验检测试剂盒购自美国Abcam公司；血细胞计数板购自海德创业(北京)生物科技有限公司，流式细胞仪购自赛默飞世尔科技(上海)有限公司，荧光显微镜购自日本Olympus公司，显微手术器械购自苏州明仁医疗器械公司，冰冻切片机购自德国Leica公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠BMSC分离和制备取SD大鼠2只(雌雄各1只)，采用颈椎脱臼法处死，以体积分数75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离胫骨、股骨，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)反复冲洗，去除干骺端，充分暴露骨髓腔，应用10 mL注射器抽取含有体积分数10%胎牛血清的培养基进行骨髓腔冲洗，应用吸管吹打收集的细胞，将细胞以1×109L-1密度接种于培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中，48 h后全量换液1次，制备大鼠BMSC。

1.3.2 BMSC鉴定(1)细胞形态观察：分别取分离培养的细胞，倒置显微镜下观察细胞形态。(2)生长曲线鉴定：取第3代BMSC，胰蛋白酶消化后调整细胞浓度，以1×107L-1，接种于24孔细胞培养板中，应用血细胞计数板计数，取均值，连续观察7 d，绘制细胞生长曲线。(3)流式细胞仪鉴定：取第3代BMSC，胰蛋白酶消化后PBS冲洗3次，细胞浓度控制在3.9×108L-1，取4 mL，分别装入4支离心管中，每支离心管内1 mL，再分别加入CD45、CD29及CD44抗体，空白对照不做任何处理，连续孵育30 min后，使用流式细胞仪测定CD45+、CD29+及CD44+细胞纯度。

1.3.3 BMSC悬液制备取BMSC培养液5 μL，加入2 mL氯甲基苯甲酰胺-1,1,-二十八烷基-3,3,3,3,-四甲基吲哚碳菁(chlormethylbenzamido-1,1,-dioctadecyl-3,3,3,3,-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,CM-Dil)荧光液，完成细胞标记，轻轻吹打3 min，1 500 r·min-1离心5 min，弃去上层清液，采用生理盐水重悬BMSC，控制细胞密度为1×109L-1。

1.3.4 RP大鼠模型制备及处理将45只大鼠随机分为对照组、RP组和BMSC组，每组15只。对照组大鼠正常饲养，不制备RP大鼠模型。RP组和BMSC组大鼠采用碘酸钠(NaIO3)法建立RP大鼠模型：取新鲜配制的40 g·L-1NaIO3溶液，使用1 mL注射器对每只大鼠局部视网膜下注射0.15 mL NaIO3溶液(40 g·L-1)，每日1次，连续注射7 d。本研究中SD大鼠均建模成功，未见感染、死亡大鼠[7]。建模成功后，RP组大鼠局部视网膜下注射0.15 mL生理盐水，BMSC组大鼠局部视网膜下注射BMSC悬液0.15 mL(细胞密度为1×109L-1)，每日1次，连续注射7 d；干预完毕后以酒精棉球擦拭、消毒注射部位，正常饲养1个月[8]。对照组大鼠不采取任何干预措施。

1.3.5 血清BDNF、IL-10水平检测分别于造模前、造模后及干预后1个月采集3组大鼠空腹状态下尾静脉血3 mL，1 500 r·min-1离心5 min，将上清液转移到新的EP管中，采用酶联免疫吸附试验测定血清BDNF、IL-10水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察各组大鼠视网膜组织病变部位组织形态干预后1个月，采用断颈法处死大鼠，完整取出眼球，剪除角膜和视神经；40 g·L-1多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明；石蜡包埋，切片(厚度约4 μm)，烤片；二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；苏木精、伊红染色，中性树胶封片；光学显微镜下观察各组大鼠视网膜病变部位组织形态[9]。

2 结果

2.1 大鼠BMSC形态倒置显微镜观察显示，制备的BMSC培养2 h后开始贴壁生长，培养2 d后伸出伪足，且长短不一(见图1A)；培养4 d后快速增长，细胞开始集落排列，细胞质丰富(见图1B)；细胞传代后分布相对均匀，形态纤长，细胞排列一致，呈旋涡或放射状(见图1C)。

A：BMSC培养2 d;B：BMSC培养4 d;C：第3代BMSC。

2.2 大鼠BMSC生长曲线细胞生长曲线显示(图2)，BMSC接种第1～2 天为潜伏期，细胞生长相对缓慢；BMSC接种第3～5天为对数生长期，细胞生长迅速。

图2 SD大鼠BMSC生长曲线

2.3 大鼠BMSC流式细胞术检测结果第3代大鼠BMSC流式细胞术检测显示，CD45+、CD29+、CD44+细胞率分别为1.33%、79.95%、81.49%，见图3。

A：CD45+细胞；B：CD29+细胞；C：CD44+细胞。

2.4 3组大鼠血清BDNF、IL-10水平比较结果见表1。造模前，3组大鼠血清BDNF、IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，RP组和BMSC组大鼠血清BDNF、IL-10水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。RP组和BMSC组大鼠造模后血清BDNF、IL-10水平显著低于造模前，差异有统计学意义(P<0.05)；BMSC组大鼠干预后血清BDNF、IL-10水平显著高于造模后，差异有统计学意义(P<0.05)；干预后，BMSC组大鼠血清BDNF、IL-10水平显著高于RP组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组大鼠造模前、造模后、干预后血清BDNF、IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 3组大鼠血清BDNF和IL-10水平比较

2.5 干预后1个月3组大鼠视网膜病变部位组织形态结果见图4。HE染色显示，对照组大鼠视网膜细胞排列整齐，细胞完好；RP组大鼠视网膜细胞排列紊乱，存在许多细胞碎片；与RP组比较，BMSC组大鼠视网膜细胞排列相对整齐，细胞碎片显著减少。

A：对照组；B：RP组；C：BMSC组。

3 讨论

间充质干细胞是干细胞的一种，该细胞源于胚胎发育的中胚层，是一种多功能干细胞，具备自我更新、多向分化及免疫抑制等多种作用。有研究显示，将间充质干细胞用于RP中有助于改善视觉敏感度、视网膜电流图等，可抑制感光细胞层的细胞凋亡，从而维持内环境的稳定[10]。为了保证本研究的顺利完成，实验开始就分离并制备BMSC。目前BMSC体外分离方法较多，主要包括贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法等[11]。

本研究通过贴壁法进行BMSC分离与制备，发现BMSC培养2 h后开始贴壁生长，2 d后伸出伪足，4 d后快速增长，呈梭形；BMSC接种第1～2 天为潜伏期，细胞生长相对缓慢；BMSC接种第3～5天为对数生长期，细胞生长迅速。大鼠第3代BMSC流式细胞术检测显示，CD45+、CD29+、CD44+细胞率分别为1.33%、79.95%、81.49%；表明贴壁法可以获得纯度相对较高的BMSC，并且操作方法相对简单，为本研究的顺利进行提供了一定的基础。

间充质干细胞能够分泌大量的神经营养因子，包括成纤维细胞生长因子、BDNF等，而BDNF是维持细胞功能、影响神经细胞生长和诱导细胞分化的重要因素。同时，间充质干细胞还能够分泌各种炎症相关的细胞因子，如IL-6、IL-10等，这些细胞因子在体内可以调节由T细胞介导的免疫反应，还对树突状细胞和巨噬细胞等的成熟、分化和增殖等起到显著调节作用。本研究结果显示，RP组和BMSC组大鼠造模后血清BDNF、IL-10水平显著低于造模前，BMSC组大鼠干预后血清BDNF、IL-10水平显著高于造模后；干预后，BMSC组大鼠血清BDNF、IL-10水平显著高于RP组；另外，HE染色显示，RP组大鼠视网膜细胞排列紊乱，存在许多细胞碎片；与RP组比较，BMSC组大鼠视网膜细胞排列相对整齐，细胞碎片显著减少；该结果提示BMSC能够促进RP大鼠受损视网膜修复。BMSC对RP大鼠受损视网膜修复的可能作用机制为：(1)血-视网膜屏障是维持人体视网膜结构与功能的重要系统，能调节内环境的稳定性，BMSC移植后能缩小细胞之间的间隙，降低视网膜血管的通透性，为视网膜定向归巢创造条件[12]；(2)BMSC移植后能对视网膜形成相应的保护作用，有助于延缓病情发展，促进受损神经细胞恢复；(3)BMSC本身具备神经营养、抑制炎症反应等作用，有助于维持细胞功能，抑制炎症反应，且对巨噬细胞、树突状细胞的成熟、分化及增殖等有良好的调节作用。

综上所述，贴壁法能成功制备大鼠BMSC，BMSC可以显著提高RP大鼠血清BDNF、IL-10水平，促进受损视网膜修复，但其具体机制尚有待进一步研究。