Umutumwa Eric Principe，乔郅钠，龙梦飞，邵明龙，徐美娟，2，杨套伟，张 显，饶志明*

(1.江南大学 生物工程学院/工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡214122；2.江南大学(如皋)食品生物技术研究所,江苏 南通226500)

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用[1-9]。因此,目前针对4-HIL的研究也越来越多。

酶催化法进行(2S,3R,4S)-4-HIL的合成是比较理想的方法[10]。Kodera等于2009年首次在苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中发现了一种酶IDO,这种酶能特异性地催化底物L-ILe生成(2S,3R,4S)-4-HIL[11-14],该酶的发现为4-HIL的生物合成奠定了基础。此外,Smirnov等通过对菌株进行代谢途径以及过表达羟化酶的方式实现了L-ILe向4-HIL的转化,其产率高达82%[13]。近年来,天津科技大学陈宁等通过代谢工程改造,在L-ILe高产菌株谷氨酸棒杆菌中实现了4-HIL的高产,产量高达34.21 g/L[15]。

IDO属Fe/αKGDs家族酶,L-ILe羟基化生成4-HIL的反应过程中需要氧气及辅因子包括Fe2+、α-酮戊二酸(α-KG)和抗坏血酸[16-18]。此外,该酶受pH影响较大,且存在底物抑制现象。因此,对此酶进行改造,并对比酶活提高的突变株的羟基化反应体系进行研究,将会为4-HIL的高效合成提供理论基础。

作者克隆了江南大学菌种库保藏的苏云金芽孢杆菌的ido基因,通过同源建模和蛋白质结构分析,对该基因进行定点突变,构建了比酶活提高的突变型菌株E.coliBL21/pET28a-idoI156A,然后对其催化体系进行研究,并在最优条件下对突变株进行补料分批转化,最终得到77.3 mmol/L 4-HIL,为高效合成4-HIL提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)以及质粒pET28a均由作者所在实验室保藏。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)由江南大学微生物菌种保藏中心保藏。

1.1.2 主要实验试剂 限制性内切酶(EcoR I、Hind III)、DL10000 DNA Marker、蛋白质marker：购于大连宝生物公司；高保真酶、同源重组酶克隆试剂盒：购自南京诺维赞生物科技有限公司；2,4-二硝基氟苯、N,N-二甲基甲酰胺、L-异亮氨酸(2S,3R,4S)-4-HIL标准品：购于阿拉丁公司；分析纯α-酮戊二酸：购于麦克林公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 引物设计 PCR扩增所用引物通过南京金唯智生物有限公司来合成,引物见表1。

表1 基因克隆及定点突变引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and gene

1.1.4 培养基及底物转化液的配制 LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10,酵母粉5,氯化钠10；pH 7.0,固体培养基则加1.5~2.0 g/dL的琼脂粉,121℃灭菌20分钟。

1.2 野生型菌株与突变菌株的构建

1.2.1 突变点的选择 根据克隆得到的L-异亮氨酸羟化酶基因表达后的氨基酸序列,利用Swiss-Model和I-TASSER网站进行L-异亮氨酸羟化酶三维结构的构建。本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成Ala的原则,对该基因I156位点进行定点突变。

1.2.2ido基因及含突变点基因的克隆 根据NCBI上Bacillus thuringiensisstrain TUST1的ido(GenBank：KC884243.1)序列设计引物(见表1),以IDO-F和IDO-R为引物,以苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的基因组为模板进行PCR扩增ido基因。

采用重叠延伸定点突变的方式对ido基因进行突变。以ido基因的上游引物(IDO-F)和引入突变的下游引物(I156A-R)、ido基因的下游引物(IDOR)和引入突变的上游引物(I156A-F),分别进行PCR扩增,得到2段含I156A突变点的基因序列；然后以这2段序列互为模板,以IDO-F和IDO-R为引物,继续进行PCR扩增,则得到包含突变点的基因序列。PCR条件为：95℃预变性10 min；95℃变性45 s,58℃复性45 s,72℃延伸1 min,30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 重组菌E.coliBL21/pET28a-ido和E.coliBL21/pET28a-idoI156A的构建 分别将上面PCR得到的产物进行胶回收,胶回收的产物与经EcoR I和Hind III双酶切线性化的pET28a载体通过同源重组的方式进行连接,然后将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),即可获得E.coliBL21/pET28aido野生型菌株和E.coliBL21/pET28a-idoI156A突变型菌株。

1.3 野生菌株与突变菌株的诱导表达及分离纯化

将野生菌株与突变菌株先在LB固体培养基上进行活化,然后按1%的接种体积分数接种于10 mL LB液体培养基,培养基中加入终质量浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性,37℃、180 r/min振荡培养10~12 h,之后再按1%的接种体积分数,转接到50 mL的LB培养基中,培养基中加入终质量浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性。最后按参考文献[10]对其进行诱导表达,SDS-PAGE检测看酶的表达情况,其中对照为不含目的基因的、转化有pET28a的E.coliBL21(DE3)。经Ni-NTA亲和层析柱对野生酶IDO及突变酶I156A进行纯化[19],Bradford法测定纯化的野生酶和突变酶的浓度,标准样品为牛血清蛋白。

1.4 酶活测定与产物4-HIL的检测

酶活测定体系：20 mmol/L L-ILe,20 mmol/L α-KG,1 mmol/L FeSO4·7H2O,5 mmol/L抗坏血酸,pH 7.0的50 mmol/L HEPES,2 mg/mL纯酶。

1个酶活力单位是指在25℃条件下,单位时间催化L-ILe反应生成1μmol产物4-HIL所需的酶量。比酶活定义为每毫克蛋白质所具有的酶活,单位为U/mg。

产物4-HIL的HPLC检测方法为[20],转化液经衍生化处理后,用C18柱反相高效液相色谱测定；洗针用体积分数10%甲醇；后进行自动进样,氨基酸洗脱方法为：T=33℃,λ=360 nm,进样20μL,时间为30 min,流量为1 mL/min。

1.5 野生酶与突变酶酶学性质的测定

1.5.1 最适反应温度 1 mL反应体系内加入20 mmol/L L-异亮氨酸、20 mmol/Lα-KG、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗坏血酸和900μL pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液,然后分别加入100μL的野生酶与突变酶,迅速放入不同温度的水浴锅中进行反应,30分钟后,沸水浴5 min终止反应,离心取上清液,HPLC测定酶活。

1.5.2 最适反应pH值 同样采用1 mL的反应体系,保持反应温度为25℃,将反应的缓冲液更换成不同pH值的柠檬酸钠-柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0~5.0)、PBS缓冲液(pH 6.0~8.0)和Tris-HCl缓冲液(pH 9.0~10.0),pH值的反应梯度为1,然后分别加入野生酶与突变酶反应30 min,沸水浴5 min终止反应,离心取上清液,HPLC测定酶活。

1.5.3 温度稳定性 将野生酶与突变酶放在不同的温度(30~50℃)下,热处理不同时间,然后在25℃、pH 7.0的条件反应30 min,HPLC法下测残余酶活,以保温前的酶活为100%,测定热处理不同时间后野生酶及突变酶在不同温度下的残余酶活。

1.6 野生酶与突变酶比酶活比较

在1 mL的反应体系中加入20 mmol/L L-异亮氨酸、20 mmol/Lα-KG、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗坏血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液,然后分别加入100μL 2 mg/mL的野生酶与突变酶,25℃反应30分钟后,沸水浴5 min终止反应,离心取上清液,HPLC测定酶活。

1.7 野生酶与突变酶的结构分析

利用Swiss-Model和I-TASSER网站同源建模获得L-异亮氨酸羟化酶的结构模型,利用Pymol软件对L-异亮氨酸羟化酶可能的底物结合位点进行分析[21],本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成Ala的原则,对I156位点进行了定点突变。最后,通过Discover Studio 4.0进行底物L-ILe和L-异亮氨酸羟化酶的分子对接[22],并利用VMD软件对对接结果进行分析[23]。

1.8 突变菌株催化体系研究

1.8.1 底物L-ILe浓度对4-HIL产生的影响 设置不同底物浓度10～60 mmol/L,分别加入20 mmol/L α-KG、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗坏血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液,25℃、pH 7.0条件下反应30 min。HPLC检测4-HIL产量。

1.8.2 α-KG浓度对4-HIL产生的影响 设置不同α-KG浓度为10～50 mmol/L,分别加入20 mmol/L L-ILe、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗坏血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液,25℃、pH 7.0条件下反应30 min。HPLC检测4-HIL产量。

1.8.3 Fe2+浓度对4-HIL产生的影响 设置Fe2+浓度 分 别 为0.5、1.5、2.5、3.5、5.0、6.5、8.0 mmol/L和10.0 mmol/L,分别加入20 mmol/L L-ILe、20 mmol/L α-KG、5 mmol/L抗坏血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液,25℃、pH 7.0条件下反应30 min。HPLC检测4-HIL产量。

1.8.4 抗坏血酸浓度对4-HIL产生的影响 设置不同抗坏血酸浓度为10～50 mmol/L,分别加入20 mmol/L L-ILe、20 mmol/Lα-KG、8 mmol/L FeSO4·7H2O和pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液,25℃、pH 7.0条件下反应30 min。HPLC检测4-HIL产量。

1.8.5 不同转化液对4-HIL产生的影响 在L-ILe、α-KG、FeSO4·7H2O和抗坏血酸浓度均为最优的情况下,分别研究了H2O、pH 7.0的50 mmol/L Bis-Tris缓冲液、pH 7.0的50 mmol/L Tris-HCI缓冲液、pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液和pH 7.0的50 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液共5种转化液对4-HIL的产生有无影响；在25℃、pH 7.0条件下反应30 min。HPLC检测4-HIL产量。

1.9 野生菌与突变体分批补料生产4-HIL

在50 mL体系中,分别加入20 mmol/L L-ILe、20 mmol/Lα-KG、8 mmol/L FeSO4·7H2O、30 mmol/L抗坏血酸、pH 7.0的50 mmol/L HEPES以及相同量的野生酶与突变酶(OD600nm大约为50左右破细胞所得粗酶液),每隔4小时投加底物一次,在投加底物前后均取样,HPLC检测4-HIL产量。

2 结果与分析

2.1 重组菌的克隆及表达

2.1.1 野生型菌株与突变菌株的构建情况 以提取的苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的基因组为模板,按1.2中方法进行PCR扩增,将所得PCR产物进行核酸电泳,跑胶结果见图1,ido基因及含点突变的基因大小均为723 bp左右。

图1 ido基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of ido gene and mutated gene

将胶回收的PCR产物与经过EcoR I和Hind III双酶切线性化的pET28a质粒进行同源重组酶切连接,然后将连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,涂卡那霉素抗性平板,37℃培养8~12 h。挑取平板上的转化子,进行菌落PCR验证(见图2),验证为阳性的转化子送往测序机构进行测序。测序如正确,则野生型菌株E.coliBL21/pET28a-ido和突变型菌株E.coliBL21/pET28a-idoI156A构建成功。根据测序结果分析,ido基因的序列和NCBI上Bacillus thuringiensisstrain TUST1的ido基因序列相似度为97.65%,将苏云金芽孢杆菌的ido基因和研究较为清晰的Bacillus thuringiensis2-e-2的ido序列进行对比分析,发现该基因的核苷酸和氨基酸序列相似度分别为98.06%和98.75%。

图2 菌落PCR验证Fig.2 Colony PCR verification

2.1.2 野生酶和突变酶的诱导表达及纯化 将构建好的野生型菌株和突变型菌株先进行划线活化12~24 h,然后接种在含10 mL LB液体培养基的小瓶,最后转接种至含50 mL LB液体培养基的大瓶,37℃、180 r/min培养大约2~3 h,待菌体的OD600nm大约为0.6左右时,添加IPTG进行诱导(IPTG终浓度为0.1 mmol/L),最后,在25℃、180 r/min条件下诱导20 h左右。

将诱导完的野生型菌株和突变型菌株进行离心收集菌体,进行细胞破碎,离心获得细胞破碎上清液,然后进行SDS-PAGE电泳看蛋白质的表达情况(见图3),结果显示,野生酶和突变酶均有表达,大小为27 900左右。

图3 IDO蛋白质的表达Fig.3 IDO protein expression

将细胞破碎液的上清液进行纯化,将纯化后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析,其结果见图4。

图4 SDS-PAGE分析野生酶和I156A突变酶的纯化Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

2.2 L-异亮氨酸羟化酶的催化功能验证

采用2,4-二硝基氟苯对L-ILe和(2S,3R,4S)-4-HIL标准品及转化液进行衍生化处理,通过HPLC法对其进行分析。L-ILe标准品、(2S,3R,4S)-4-HIL标准品和转化液的HPLC分析结果分别见图5(a)—(c)。

图5 L-ILe,(2S,3R,4S)-4-HIL标准品及转化液的HPLC图谱Fig.5 HPLC chromatogram of L-ILe,(2S,3R,4S)-4-HIL standards and conversion solutions

2.3 野生酶与突变酶的部分酶学性质比较分析

2.3.1 野生酶与突变酶的最适反应温度和最适pH测定 将野生酶和I156A突变酶分别置于不同的温度下,测定它们在不同温度下的酶活,见图6(a),野生酶和突变酶的最适反应温度并没有发生明显变化,都为25℃左右。当温度高于25℃时,野生酶相对酶活下降速度比突变酶快。

将野生酶和I156A突变酶分别置于不同的pH中,测定它们在不同pH下的酶活,如图6(b)所示,重组酶和突变酶的最适反应pH并没有发生明显变化,都为7.0。

图6 野生酶和I156A突变酶的最适温度和最适pHFig.6 Optimum temperature and p H for wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

2.3.2 野生酶与突变酶温度稳定性测定 将野生酶与突变酶分别在30、35、40℃和50℃下放置不同时长,然后与未进行热处理的酶一起测酶活,结果见图7。从图7(a)可知,野生酶在30、35℃和40℃下处理8 h,仍保持80%以上的比酶活；而在50℃下热处理2 h,IDO基本丧失活性。而从图7(b)可知,突变体的温度稳定性与野生酶基本无区别,也就是说,突变酶I156A的热稳定性并没有得到改善。

2.4 野生酶与突变酶比酶活比较分析

在酶量相同的情况下,比较野生酶及突变酶的酶活并计算其比酶活。如图8,野生酶的比酶活为0.84 U/mg,突变酶的比酶活是野生酶的1.9倍,为1.58 U/mg。

图7 野生酶和I156A突变酶的热稳定性Fig.7 Thermal stability of wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

图8 野生酶和I156A突变酶的比酶活Fig.8 The specific activity of wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

2.5 野生酶及突变酶结构解析结果

L-异亮氨酸羟化酶属Fe2+和α-KG依赖型酶,因此,将L-异亮氨酸羟化酶与Fe/αKGDs家族典型酶TauD(1GY9)进行结构对比,对底物结合位点进行预测,推测其底物结合位点可能是H139、Y81、P155和D162。因此,选取P155位点对底物L-ILe进行分子对接。

从对接结果来看(见图9),第156位的异亮氨酸(I)突变成丙氨酸(A)后,底物L-ILe的结合口袋变大了,拓宽了底物通道。

图9 野生酶与I156A突变酶与底物L-ILe的分子对接Fig.9 Molecular docking of wild-type enzyme and I156A mutated enzyme with substrate L-ILe

2.6 突变株羟基化反应催化体系的研究

2.6.1 底物L-ILe浓度对4-HIL产量的影响 从图10可知,在L-ILe浓度为20～50 mmol/L时,4-HIL产量变化不大,且在L-ILe浓度为20 mmol/L时,转化率最高,为87.5%,此时4-HIL产量为10.1 mmol/L；当L-ILe浓度为60 mmol/L时,转化率下降为53.6%,此时4-HIL产量仅为7.41 mmol/L。

图10 L-ILe浓度对4-HIL产量的影响Fig.10 Effect of L-ILeconcentration on 4-HIL production

2.6.2 α-KG浓度对4-HIL产量的影响 IDO羟基化反应需要α-KG的参与,其羟基化反应与α-KG氧化脱羧反应相耦联,因此反应体系中α-KG浓度会影响IDO的酶活及4-羟基异亮氨酸的合成[8,13,24]。

如图11所示,α-KG浓度在10～20 mmol/L时,4-HIL产量随着α-KG浓度的升高而升高,当α-KG浓度为20 mmol/L时,4-HIL产量达到最大,为12.92 mmol/L。当α-KG浓度高于20 mmol/L时,4-HIL产量下降,特别是α-KG浓度为50 mmol/L时,4-HIL产量仅为5.44 mmol/L。可能是因为高浓度的α-KG抑制了IDO的羟基化反应,使整个反应趋向于α-KG氧化脱羧,生成了副产物琥珀酸,而琥珀酸的过量积累不利于4-HIL的产生。

图11 α-KG浓度对4-HIL产量的影响Fig.11 Effect ofα-KGconcentration on 4-HIL production

2.6.3 Fe2+浓度对4-HIL产量的影响 在L-ILe羟基化生成4-HIL的反应过程中,Fe2+会与α-KG的C1位的羧基和C2位的羰基结合进而形成八面配位体复合物,在α-KG氧化脱羧的同时,Fe2+会被氧化生成高价铁-超氧复合体(Fe(IV)=O),而Fe(IV)=O是L-ILe羟基化生成4-HIL过程中的关键复合体,因此,酶促反应体系中Fe2+的含量会影响Fe(IV)=O的形成和4-HIL的产生[8]。由图12可知,4-HIL的产量随着Fe2+浓度的升高而升高,当Fe2+浓度为8 mmol/L时,4-HIL产量最高,为13.5 mmol/L；当Fe2+浓度升高至10 mmol/L时,4-HIL产量下降为5.32 mmol/L。

图12 Fe2+浓度对4-HIL产量的影响Fig.12 Effect of Fe2+concentration on 4-HIL production

2.6.4 抗坏血酸浓度对4-HIL产量的影响 在L-ILe羟基化生成4-HIL的反应过程中,不光要有适当浓度的Fe2+,同时也必须要有充足的氧气。如图13,抗坏血酸浓度在10～30 mmol/L时,4-HIL的产量随着抗坏血酸浓度的升高而升高,且在抗坏血酸浓度为30 mmol/L时,4-HIL产量达到最高,为13.9 mmol/L。这可能是因为抗坏血酸浓度在10～30 mmol/L时,能够将被氧化的Fe2+还原,且在抗坏血酸浓度为30 mmol/L时,Fe2+浓度也为最适浓度,4-HIL产量最高；当抗坏血酸浓度高于30 mmol/L时,一方面抗坏血酸将被氧化的Fe2+还原导致Fe2+浓度过高,影响Fe(IV)=O的形成；另一方面,抗坏血酸会消耗氧气进而影响反应体系的氧化性,因此,4-HIL产量降低。

图13 抗坏血酸浓度对4-HIL产量的影响Fig.13 Effect of ascorbic acid concentration on 4-HIL production

2.6.5 不同转化缓冲液对4-HIL产量的影响 在L-ILe羟基化生成4-HIL的反应过程中,Fe2+和整个反应体系的pH会对4-HIL的产生有影响,因此,需分析不同转化液对4-HIL产量有无影响,结果见图14。由图可知,pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液更适合4-HIL的生产,产量高达14.8 mmol/L。这可能是因为HEPES缓冲液具有很好的缓冲能力,能够将反应体系的pH较长时间维持在7.0左右。

图14 不同转化缓冲液对4-HIL产量的影响Fig.14 Effect of different transformation buffers on 4-HIL production

2.7 野生型菌株和突变型菌株粗酶液分批转化结果

从图15可知,在转化的前8 h,野生型菌株与突变株4-HIL产量相近,野生型菌株4-HIL产量为24.6 mmol/L,突变株4-HIL产量为28.4 mmol/L；但8 h以后,野生型菌株转化L-ILe生成4-HIL的能力下降,而突变株转化能力虽有下降但仍较野生型高。最后,转化32 h后,野生型菌株4-HIL产量仅为54.2 mmol/L,而I156A突变株4-HIL产量达到77.3 mmol/L,为野生型菌株的1.43倍。突变株4-HIL产量提高的可能原因是,由于突变,底物口袋变大,拓宽了底物通道。对于野生型菌株来说,酶结构底物口袋很快达到饱和状态,即使再投加底物,酶已不能继续进行催化；但突变后,底物口袋可以容纳更多的底物,因此,4-HIL产量较野生型高。

3 结 语

4-HIL的药理作用较为广泛,主要包括降血糖、降血脂、改善外周组织对胰岛素的抵抗性等,是一种非常有前景的药物。作者从苏云金芽孢杆菌中克隆L-异亮氨酸羟化酶(IDO),在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,并对其部分酶学性质进行研究。然后通过同源建模和蛋白结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成Ala的原则,对该基因I156位点进行定点突变。突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍。最后以突变体重组菌I156A出发,考察羟基化反应体系中,底物L-ILe浓度、α-酮戊二酸浓度、Fe2+浓度、抗坏血酸浓度以及转化液对4-HIL产生的影响。确定了最终转化体系为：20 mmol/L L-异亮氨酸、20 mmol/Lα-KG、8 mmol/L FeSO4·7H2O、30 mmol/L抗坏血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES缓冲液。在最优转化体系条件下结合分批补料的方式,转化32 h,可以产生77.3 mmol/L 4-HIL。

此外,在研究不同转化液对4-HIL产量的影响时,发现用纯水作为转化液,依然可以转化底物L-ILe生成4-HIL,可以降低生产成本。

图15 野生型菌株和I156A突变株的分批转化Fig.15 Batch conversion of wild-type stain and the mutated strain I156A