杨 蕾，丁学峰，蔡燕飞，陈 蕴，龚笑海，段作营，李华钟，金 坚*

(1.江南大学 生物工程学院,江苏 无锡214122；2.江南大学 药学院,江苏 无锡214122)

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞作为生物技术药物生产细胞的优势地位已经明确,且构建适于稳定生产治疗性生物制品的CHO工程细胞系一直是研究工作的热点[1-2]。经典的CHO工程细胞系构建均是采用目的基因随机整合,多轮单克隆筛选,挑选相对稳定表达目的蛋白细胞株的方法[3-4]。带来的麻烦是构建工作费时费力,更重要的是无法知晓高、低表达目的蛋白的原因。随着主细胞库到生产细胞库的放大和生产过程传代,目的蛋白的表达量极易变化,丢失了目的蛋白表达的非生产性细胞克隆持续增加,难以达到生产和监管的要求。构建定点整合的稳定表达外源基因的CHO工程细胞系是理论上解决这些问题的有效方法。CHO细胞的一、二和三代基因测序结果均已相继公布,相关品系的CHO细胞染色体变异很大。对已保有的各种生产治疗性生物制品的高、低表达CHO细胞株,结合其整合位点和临近区域的结构分析,还未有成功地将CHO细胞的稳定高表达整合位点用于建立生产型CHO工程细胞系的报道[5-7]。

作者前期以CHO-K1为出发细胞株,组合应用慢病毒示踪报告基因技术和染色体步移技术,寻找到了可以持续表达绿色荧光标签的基因组内位点。测序结果明确了该整合位点为NW_003614172.1第629890碱基处,位于钾通道调节因子1(potassium channel modulatory factor 1,Kcmf1)基因内部的一段非编码区域。该基因编码锌指蛋白,参与钾通道的调节[8-9]。……