刘培刚，林天宝，朱 燕，刘 岩，吕志强，魏 佳

（浙江省农科院蚕桑所，浙江 杭州 310021）

作为传统蚕桑产业的重要物质基础的桑树（Morus albaL.），同其他植物一样，在遭受高温、低温、盐碱、干旱及水涝等恶劣环境影响的时候自身会产生一定的抗逆反应；而抗逆反应的强弱关系到其生存适应性、生长发育及衰老等生理过程[1]。可溶性蛋白参与机体代谢与渗透调节；MDA是机体抗逆膜脂过氧化产物；而抗氧化酶体系对于机体遭受胁迫时产生保护作用，它们均与桑树等植物的抗逆性反应存在着密切关系，其含量或活力变化是桑树等植物生长发育、衰老及抗逆性等生理过程常见的生化检测指标[2，3]，因此，对于如何保证预待测酶液得到合理地提取及测定显得至关重要，影响桑树等植物的抗逆性、生理及病理等过程机理分析的准确性。

在已有文献报道中，生物生理生化指标检测研究中其含量或酶活力检测结果受到温度、时间及提取缓冲液等多方面因素的影响，其中，提取缓冲液的选择是一项保证酶活力得到准确检测的重要影响因素，在很大程度上影响酶液的提取效果，而磷酸盐缓冲液、生理盐水等提取缓冲液是实验研究中常采用的提取缓冲液种类[4，5]。

本研究就文献研究中常用的磷酸盐缓冲液、生理盐水等提取缓冲液是否会对桑叶中可溶性蛋白含量、MDA含量及SOD、CAT、POD的活力测定存在影响进行了对比分析，为更准确地实施桑叶生理生化指标测定工作提供数据方面的支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：红果3号、A18、白桑椹、72c002、桂桑优12及杂交桑（农14）6个桑树品种；桑树样本栽植于温州海涂围垦区。

分别从6个品种5株桑树上采集成熟第6片叶若干，采摘后迅速液氮冷冻，然后置于冷冻干燥机冷冻干燥后（-100℃），磨碎后过100目筛，所得桑叶粉样本保存备用。

可溶性蛋白、SOD、CAT、POD、MDA试剂盒购于南京建成生物技术有限公司。

1.2 酶液的提取

称取上述制备0.2 g桑叶粉样本，依据说明书方法所推荐的料液比（1∶9或1∶19）加入相应体积的生理盐水（0.9%）或磷酸盐缓冲液（pH7.2），研钵置于冰上研磨1 min，然后将匀浆倒入离心管中并置于冰上继续提取30 min。提取结束后，3500 rpm、4℃进行离心10 min，离心结束后取上层酶液。各样本保存于-80℃冰箱用于检测。上述6个桑叶样本各重复提取3次。

1.3 蛋白检、MDA、SOD、CAT、POD质量或活力测定

各生理生化质量或活力检测，均严格按照相应试剂盒说明书提供操作步骤实施，每个样品重复各测定3次，然后根据试剂盒说明书所提供的公式进行统计与计算。

1.4 统计学分析

所获得数据均运用SPSS 20.0统计学软件进行处理，检测结果采用均数±标准差（xˉ±s）表示，组间比较运用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种提取缓冲液对桑叶可溶性蛋白质提取的影响

2种提取缓冲液对不同桑树品种叶片可溶性蛋白质提取效果的影响，结果见表1。

由表1结果可以看出：各桑叶样本可溶性蛋白提取效果，磷酸盐缓冲液组均优于生理盐水组；就平均提取效果而言，磷酸盐缓冲液对桑叶的可溶性蛋白提取效果要优于生理盐水，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 2种提取缓冲液对于桑叶MDA含量检测的影响

2种提取缓冲液对于不同桑树品种叶片中MDA含量检测效果的影响，结果见表2。

由表2结果可以看出，生理盐水作为提取缓冲液，各桑树品种MDA含量检测值均高于磷酸盐缓冲液；就平均提取效果而言，对于桑叶中MDA含量检测效果，生理盐水作为提取缓冲液要优于磷酸盐缓冲液，具有显著性差异（P＜0.05）。

2.3 2种提取缓冲液对于桑叶SOD活力检测的影响

2种提取缓冲液对于不同桑树品种叶片SOD活力检测效果的影响，结果见表3。

由表3结果可以看出：桑叶SOD活力检测的影响方面，磷酸盐缓冲液与生理盐水受到桑树品种的影响；就品种平均检测效果而言，磷酸盐缓冲液的效果要高于生理盐水，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 2种提取缓冲液对桑叶可溶性蛋白质提取效果的影响（mg/ml）Table 1 Extraction Effect of Soluble Protein From Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（mg/ml）

表2 2种提取缓冲液对桑叶MDA含量检测效果的影响（nmol/mgprot）Table 2 Assay of MDA Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（nmol/mgprot）

表3 2种提取缓冲液对桑叶SOD活力检测的影响（U/mgprot）Table 3 Assay of SOD Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（U/mgprot）

表4 2种提取缓冲液对桑叶CAT活力检测的影响（U/mgprot）Table 4 Assay of CAT Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（U/mgprot）

表5 2种提取缓冲液对桑叶POD活力检测效果的影响（U/mgprot）Table 5 Assay of POD Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（U/mgprot）

2.4 2种提取缓冲液对于桑叶CAT活力检测的影响

2种提取缓冲液对于不同桑树品种叶片CAT活力检测效果的影响，结果见表4。

由表4结果可以看出，各桑叶样本CAT活力检测效果，磷酸盐缓冲液提取组效果均低于生理盐水组；就品种平均提取效果而言，生理盐水作为提取缓冲液提取效果要优于磷酸盐缓冲液，存在极显著差异（P＜0.01），因此，这也是试剂盒推荐使用生理盐水作为提取缓冲液的重要原因。

2.5 2种提取缓冲液对于桑叶POD活力检测的影响

2种提取缓冲液对于不同桑树品种叶片中POD活力检测效果的影响，结果见表5。

由表5结果可以看出，2种提取缓冲液对于POD活力检测效果影响在桑树品种间高低趋势不一；就品种平均提取效果而言，2种提取缓冲液之间差异不存在统计学意义（P＞0.05），需要针对桑树品种进行提取缓冲液选择及条件的摸索。

3 讨论

桑树是世界上一种重要的经济作物，为家蚕饲育提供天然饲料的同时，还具有药食同源的其他重要作用。桑树在遭受高温、盐碱及干旱等自然灾害的时候，其生长发育会受到影响进而带来桑叶产量、质量等降低，进而会影响其家蚕饲育、药用及食用等途，而这种影响状况同桑树品种的抗逆适应性强弱存在着密切的关系。可溶性蛋白是桑叶的重要成分之一，参与桑树的代谢及渗透调节过程；MDA是细胞膜脂过氧化损伤的反应体现；SOD、CAT、POD等抗氧化酶在桑树等植物遭受胁迫的时候进行保护调节，因此，对于这些生理生化指标的检测是研究与分析桑树等植物生理、病理与抗逆反应机理的重要因子。在进行桑叶等植物抗逆性研究的时候，准确进行酶活力检测是研究准确性的重要基础[6，7]。在进行样本抗逆性相关酶活性测定的时候，需要将样本的细胞进行破碎与提取，而提取液中所包含的一些成分对于酶活性的检测将会造成一定的影响[8]。

已有许多文献报道磷酸盐缓冲液在可溶性蛋白提取效果方面要优于生理盐水[9，10]，本研究获得了相同的结果，结果显示磷酸盐缓冲液对桑叶可溶性蛋白提取效果优于生理盐水，差异极显著（P＜0.01）；而在CAT活力、MDA含量的检测方面，生理盐水作为提取缓冲液的检测效果要显著优于磷酸盐缓冲液（P＜0.01或P＜0.05）；而对于桑叶POD活力、SOD活力的检测效果，2种提取缓冲液提取效果不存在显著差异（P＞0.05），需要依据品种进行摸索优化进行选择。

通过本研究，进一步了解了桑叶可溶性蛋白含量、MDA含量及SOD、CAT、POD等酶活力检测的提取缓冲液选择的可行性与准确性；而磷酸盐缓冲液作为提取缓冲液，待测酶容易受到缓冲液pH值的影响，因此，以后将就不同pH磷酸盐缓冲液对于桑叶生理生化指标检测的影响进行进一步的探讨，为更好地进行桑叶酶活力生理生化检测提供帮助。