大规格花鲈对饲料中缬氨酸的需求量研究

2021-05-17卫育良窦秀丽梁萌青徐后国

饲料工业 2021年8期

■卫育良窦秀丽梁萌青* 徐后国

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071；2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛266237）

缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，不但参与体内蛋白质的组成，而且参与蛋白质的合成与分解代谢[1]。作为鱼类的10 种必需氨基酸之一，之前的研究表明，饲料中缬氨酸不足，会显著影响尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[2]、美国红鱼(Sciaenops ocellatus)[3]、团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih, 1955)[4]、草鱼(Ctenopharyngodon idella Valenciennes)[5]等鱼类的生长，表明饲料中适宜的缬氨酸水平对鱼类生长具有重要意义。但是，这些研究主要集中在小规格的鱼苗及鱼种阶段，即鱼的初重小于50 g，对于体重超过100 g 的大规格鱼育成阶段的氨基酸需求研究较少。姚林杰等[6]研究发现，即使摄食配方相同的饲料，在不同生长阶段，团头鲂肌肉所含的包括缬氨酸在内的必需氨基酸含量也有差异，并据此猜测鱼类在不同生长阶段，对饲料必需氨基酸的需求不同。这一猜测在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)上得到证实，王学武[7]的研究表明，22 g 的小规格斜带石斑鱼对赖氨酸的需求量为3.04%饲料干物质(6.33%饲料蛋白)，而102 g 的大规格斜带石斑鱼对赖氨酸的需求量则为2.61%饲料干物质(5.8%饲料蛋白)，同样的，在蛋氨酸上，也发现不同规格的斜带石斑鱼必需氨基酸需求量不同。这表明，要构建鱼类精准的氨基酸营养需求数据库，不但要考虑小规格苗种阶段的缬氨酸需求量，还需要考虑大规格养成阶段的需求量。

花鲈(Lateolabrax japonicus)在我国南北方均有养殖，是一种重要的海水养殖鱼类，其缬氨酸的需求量已在初重8 g的小规格上进行研究[8]。因此，本试验拟以(182.33±1.08) g 的大规格花鲈为研究对象，通过摄食生长试验，进一步研究大规格花鲈的缬氨酸需求量，以期获得花鲈精准的缬氨酸需求数据，为花鲈商品饲料的研发提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验配制6 组粗蛋白质约为42%、粗脂肪约为7.5%的等氮等脂的基础饲料(见表1)。基础饲料的完整蛋白以鱼粉、玉米蛋白和明胶为蛋白源，剩余蛋白以混合晶体氨基酸补充，其中，晶体必需氨基酸的添加以花鲈实际体蛋白换算成43%蛋白所含的必需氨基酸含量为参考[8]，使除缬氨酸以外的其他必需氨基酸达到鱼体最适需求量(见表2)。然后，分别向基础饲料中添加0、0.40%、0.80%、1.20%、1.60%和2.00%晶体缬氨酸，以谷氨酸作为等氮替代物。为减少添加过量晶体氨基酸引起饲料pH 值减小，制备过程中用6 mol/L 的NaOH 进行pH 调节，然后制成直径为5 mm 的颗粒饲料，于55 ℃下烘干保存，并取样测定每组饲料的缬氨酸含量，测定结果分别为1.12%、1.54%、1.96%、2.28%、2.54%和2.87%饲料干物质。

1.2 试验鱼及饲养管理

本试验选择初重(182.33±1.08) g规格的花鲈为养殖对象，在浙江省宁波市象山港湾水产苗种有限公司进行养殖试验。试验开始前，将花鲈放入体积为(3 m×6 m×3 m)的海水浮式网箱中先进行2 周的暂养。然后，将花鲈随机放入体积为(1.5 m×1.5 m×2.0 m)的网箱中，试验分为6个处理组，每个处理组设3 个重复，每个网箱放入18 尾鱼，进行为期10 周的养殖试验。试验期间，每天06:00 和18:00 喂鱼，海水温度在25～30 ℃，盐度在19～22，pH值7.2～7.5，溶解氧含量大约在7 mg/L。

1.3 样品采集及生化指标测定

1.3.1 样品采集

表1 饲料配方组成及其营养水平（干物质)

表2 饲料中氨基酸组成分析(% 干物质)

养殖试验开始时，随机挑选5 尾花鲈作为初始鱼，保存在-20 ℃冰箱，用于鱼体成分分析。养殖试验结束后，饥饿24 h，对每个网箱的鱼称重和记数，用于生长性能相关指标的测定。然后，随机从每个养殖网箱中取3 尾花鲈，取肌肉和肝脏，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰柜，用于后续氨基酸及酶活性分析。最后，每个网箱再取4 尾花鲈，保存在-20 ℃冰箱中，用于鱼体成分分析。

1.3.2 生化指标分析

饲料和全鱼样品的水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分测定。用105 ℃的烘箱将饲料和全鱼样品烘干至恒重，湿重法计算样品的水分含量；用凯氏定氮法测定样品的粗蛋白质含量(VELP UDK142 automatic distillation unit，意大利)；用索氏抽提法测定样品的粗脂肪含量(FOSS 索氏抽提仪SOXTEC 2050，瑞典)；灰分含量，先进行炭化，后用马弗炉进行灰化测得。

饲料及肌肉氨基酸含量测定。根据饲料及肌肉蛋白质含量，称取适量的样品，用6 mol/L 的HCl 在110 ℃下水解22～24 h后，用氨基酸分析仪测定（日立L-8900型氨基酸分析仪，日本）。

肝脏谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)酶活性测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。肝脏谷草转氨酶活性测定采用谷草转氨酶测试盒（C010-2-1）；肝脏谷丙转氨酶活性检测采用谷丙转氨酶测试盒(赖氏法，C009-2-1)。

1.4 计算方法及统计分析方法

成活率(SR，%)=100×N1/N0

增重率(WGR，%)=100×(W1-W0)/W0

摄食率(FI，%/d)=100×W/[T×(W1+W0)/2]

特定生长率(SGR，%/d)=100×(lnW1-lnW0)/T

饲料效率(FE)=(W1-W0)/W

蛋白质效率(PER，%)=100×(W1-W0)/(W×P)

蛋白质沉积率(PPV，%)=100×(W1×P1-W0×P0)/(W×P)

式中：N0、N1——初始鱼数量和终末鱼数量；

W、W0、W1——摄食的饲料干物质重、初始鱼体重和终末体重(g)；

P、P0、P1——饲料粗蛋白、初始鱼体粗蛋白和终末鱼体粗蛋白含量(g)；

T——试验天数(d)。

所得试验数据采用“平均值±标准差”表示，采用SPSS19.0 分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，当差异达到显著（P＜0.05）水平时，用Duncan’s进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 饲料缬氨酸水平对花鲈生长及饲料利用的影响(见表3)

表3 饲料不同缬氨酸水平对花鲈生长性能的影响

由表3可知，饲料中不同的缬氨酸水平影响了花鲈的末重、增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白质效率和蛋白质沉积率。其中，末重、增重率和特定生长率这三个直接反映生长的指标随饲料缬氨酸的增加变化趋势一致，均表现为随着饲料缬氨酸的升高呈先升高后降低的趋势，且最高点出现在缬氨酸水平为1.96%组。以特定生长率为评价指标，进行二次曲线拟合(y=-0.210 4x2+0.913 7x-0.097 9，R2=0.905 1)，得到初重(182.33±1.08) g规格的花鲈缬氨酸的最适需求量为2.17%饲料干物质，占饲料蛋白的5.14%(图1)。摄食率、蛋白质效率和蛋白质沉积率均随着饲料缬氨酸水平的升高呈先升高后趋于平缓的趋势，摄食率在缬氨酸为1.54%组出现拐点，蛋白质效率和蛋白质沉积率与特定生长率等指标一致，在1.96%组出现拐点。此外，饲料效率也随着饲料缬氨酸的升高呈先升高后降低的趋势，且在缬氨酸为1.96%组出现最大值，以饲料效率为评价指标，再次进行二次曲线拟合(y=-0.111 7x2+0.478 4x+0.180 2，R2=0.821 1)，得到花鲈缬氨酸最适需求量为2.14%，占饲料蛋白的5.07%(图2)。

2.2 饲料缬氨酸水平对花鲈体组成的影响（见表4）

由表4 可知，花鲈鱼体水分含量在65.95%～68.64%之间，粗蛋白质含量在16.94%～17.60%之间，粗脂肪含量在8.60%～9.42%之间，粗灰分含量在4.05%～5.25%之间，但饲料不同缬氨酸水平对鱼体水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分均无显著影响(P＞0.05)。

2.3 饲料缬氨酸水平对花鲈肌肉必需氨基酸组成的影响（见表5）

由表5可知，饲料缬氨酸水平的增加对肌肉中的缬氨酸含量无显著影响(P＞0.05)。同样的，除缬氨酸以外的肌肉其他必需氨基酸含量也不受饲料缬氨酸水平变化的影响(P＞0.05)。

2.4 饲料缬氨酸水平对花鲈肝脏转氨酶活性的影响（见表6）

由表6可知，饲料缬氨酸水平影响了花鲈肝脏谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性，且这两个转氨酶活性均随着饲料缬氨酸水平的升高呈现先升高后降低的变化趋势，在缬氨酸水平为1.96%组出现最高值，显著高于其他各处理组(P＜0.05)。

图1 饲料中不同水平缬氨酸对花鲈特定生长率的影响

图2 饲料中不同缬氨酸水平对饲料效率的影响

表4 饲料不同缬氨酸水平对花鲈体组成的影响（%）

表5 饲料不同水平缬氨酸对花鲈肌肉必需氨基酸组成的影响(%肌肉蛋白)

表6 饲料缬氨酸水平对花鲈肝脏转氨酶活性的影响(U/g prot.)

3 讨论

饲料中植物蛋白替代鱼粉，通常会引起某一种或几种必需氨基酸缺乏，因此，研究鱼类氨基酸的适宜需求量，是获得鱼类最佳生长所需理想蛋白质模型的基础[9-10]，同时，也可以为商业饲料的配方设计提供指导。对于花鲈，目前已开展赖氨酸[11]、亮氨酸[8]、异亮氨酸[8]、缬氨酸[8]、组氨酸[8]、苯丙氨酸[12]、苏氨酸[12-13]、色氨酸[14]等多种必需氨基酸需求研究，其中，缬氨酸的研究是基于8 g 的小规格苗种阶段的研究，而对初重超过100 g的大规格养成阶段缺乏研究，因此，为进一步完善花鲈的缬氨酸需求量，本试验聚焦在初重为(182.33±1.08) g大规格花鲈的缬氨酸需求量研究。

生长结果表明，饲料中不同水平的缬氨酸影响了花鲈的末重、增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白质效率和蛋白质沉积率，这进一步说明研究大规格花鲈缬氨酸需求量对生长和饲料利用具有重要意义。本试验以生长最具有代表性的指标特定生长率和饲料利用最具代表性的指标饲料效率分别进行二次曲线拟合，得到初重(182.33±1.08) g 的大规格花鲈缬氨酸最适需求量分别为2.17%饲料干物质(5.14%饲料蛋白)和2.14%(5.07%饲料蛋白)，这一结果与同样以特定生长率和饲料效率为评价指标得到8 g小规格花鲈缬氨酸的需求量2.11%饲料干物质(5.02%饲料蛋白)的结果接近[8]。通常规格越大的鱼类，如大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、斜带石斑鱼等对饲料蛋白质的需求量越低[15-16]，同时，在团头鲂的研究上还发现，摄食同一配方饲料，规格越大，肌肉蛋白的必需氨基酸含量越低[6]，而氨基酸是组成蛋白质的基本单位，因此，理论上规格越大的鱼类，对必需氨基酸的需求量越低，并且，这一理论在不同规格斜带石斑鱼赖氨酸和蛋氨酸需求量的研究中得到验证[7]。但是，本试验的研究结果却与规格越大，必需氨基酸需求量越低的理论相矛盾，其可能的原因有两点：其一，这一理论与鱼的种类有关，例如，尽管赖氨酸在斜带石斑鱼上随着初重规格增大而需求量降低，但在团头鲂上，却发现赖氨酸需求量随着初重规格增大而升高[17]；其二，与所研究的具体氨基酸有关，因为组成鱼体蛋白质的必需氨基酸有10 种，鱼的规格越大，对饲料蛋白的需求量越低，不能代表每种氨基酸的需求量一定也跟着降低，如同一种花鲈，对缬氨酸需求量在不同规格之间接近，对异亮氨酸的需求量随规格的增大而降低[8，14]，对组氨酸和亮氨酸需求量则随着规格的增大升高[8，13-14]。这种因鱼和必需氨基酸的种类不同，相应的需求量在不同规格有明显不同的结果，暗示在设计不同规格鱼的饲料配方时，必需氨基酸需求量不能仅仅根据“规格越大，氨基酸需求量越低”来设计，而是需要依据每种鱼对应必需氨基酸的试验结果进行合理的调整。

此外，本试验还发现，末重、增重率、特定生长率和饲料效率均随着饲料缬氨酸的增加呈先升高后降低的变化趋势，其原因可能是支链氨基酸的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸在鱼体内存在颉颃效应，即支链氨基酸在肠道中的转运吸收过程共用相同的转运载体，这导致过量的缬氨酸会与其他支链氨基酸发生转运载体的竞争性抑制，导致氨基酸吸收不平衡，降低对支链氨基酸的利用效率。同时，支链氨基酸在分解过程中，也会共用支链酮酸脱氢酶，导致过量的缬氨酸与其他支链氨基酸在氧化分解过程中对支链酮酸脱氢酶产生竞争性抑制[14，18-19]。除花鲈外，生长随饲料缬氨酸的增加呈下降的趋势在南亚野鲮(Labeo rohita,Hamilton)[20]、建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)[21]、草鱼[5，22]、大黄鱼[8]等鱼类上也发现。但团头鲂[4]、真鲷(Pagrus major)[23]、美国红鱼[3]、尼罗罗非鱼[2]等鱼类随着饲料缬氨酸的增加呈现先升高后趋于平缓的趋势，出现了不同的鱼类生长结果随饲料缬氨酸的增加呈现不同的响应，可能的原因是不同鱼类对饲料中过量缬氨酸引起的支链氨基酸颉颃作用耐受能力不同[24]。

支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）是组成哺乳动物肌肉蛋白的重要氨基酸，合计占肌肉蛋白的14%～18%[18]。在本试验中，对肌肉支链氨基酸的测定也发现，花鲈的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸占肌肉蛋白为11.76%～12.10%，尽管低于哺乳动物占肌肉蛋白的含量，但也是组成鱼类肌肉的重要氨基酸。本试验中，饲料缬氨酸含量的升高对肌肉缬氨酸的含量无显著影响。同时，亮氨酸和异亮氨酸这两个支链氨基酸在肌肉中的含量也没有随饲料缬氨酸的升高而产生差异，相似的结果在初重大约6.5 g 的尼罗罗非鱼的缬氨酸需求量的研究上也发现[2]。但是在印度鲤鱼(Catla catla)稚仔鱼的研究中发现，鱼体缬氨酸含量随着饲料缬氨酸的升高呈先升高后降低的变化趋势[25]，因此，猜测肌肉缬氨酸含量受饲料缬氨酸含量的影响可能与初始鱼的大小有关。另外，Mai 等[11]认为肌肉赖氨酸含量变化可以作为花鲈饲料氨基酸需求量的评价指标，这一理论在红鳍东方鲀的赖氨酸和蛋氨酸需求量的研究上得到验证[26-27]，但是这一理论在花鲈缬氨酸需求量的研究，特别是大规格花鲈缬氨酸需求量上，并没有得到进一步证明，这表明生长可能仍然是氨基酸需求量研究的重要指标，肌肉氨基酸含量变化只能是对生长结果的一种补充验证。

谷草转氨酶和谷丙转氨酶是氨基酸分解代谢中两个重要的氨基酸分解代谢相关酶，谷草转氨酶的作用是将天冬氨酸和α-酮戊二酸催化生成谷氨酸和草酰乙酸。谷丙转氨酶的作用为将丙氨酸和α-酮戊二酸催化生成谷氨酸和丙酮酸[28-30]。在本试验中发现，肝脏的谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性均是随着饲料缬氨酸含量的升高出现先升高后降低的变化趋势，这与孙丽慧等[5]在草鱼上发现的肝脏谷丙转酶活性随饲料缬氨酸含量的变化趋势一致。由于谷草转氨酶和谷丙转氨酶催化生成的草酰乙酸和丙酮酸可以进入三羧酸循环参与能量代谢，因此，谷草转氨酶和谷丙转氨酶在适量缬氨酸处理组活性升高，可能既表明肝脏中转氨基活性的增强，也表明肝脏中能量代谢的活性增强[27]，而这些代谢活性的增强，有利于花鲈的生长，因为出现这两种转氨酶活性随饲料缬氨酸的变化与生长的变化结果一致。