■王智勇 曾建国 刘 薇*

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.中兽药湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

农业农村部第217 号公告批准了源自金银花中的绿原酸作为具有促进肉仔鸡生长、提高饲料转化效率、增强机体抗氧化能力、改善肠道菌群结构等功效的新型饲料添加剂；同时绿原酸被应用于水产饲料行业也有多年历史[1]。而异绿原酸在结构上比绿原酸多一个咖啡酰基团，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等重要生物活性，以及调血脂、抗纤维化、抗动脉粥样硬化、抑制组胺释放、抑制平滑肌收缩等临床应用价值[2]。

前期研究发现，天然异绿原酸的来源十分广泛，因其属于缩酚酸，可通过热回流提取法、大孔树脂吸附法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法等提取得到；而化学合成的异绿原酸往往副产物较多且分离困难，其合成工艺也往往成本太高。所以从天然植物中提取异绿原酸仍是研究的主流，但目前针对异绿原酸的提取工艺研究仍处于相对薄弱阶段。

1 异绿原酸化学结构

异绿原酸类化合物是经植物体内有氧呼吸过程中的莽草酸途径，由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(quinic acid)生成的缩酚酸，属于二咖啡酰奎宁酸类化合物。理论上，两个咖啡酰以不同的结构方式结合在奎尼酸上，有6 种同分异构体，但至今从天然植物中发现的二咖啡酰奎宁酸类化合物只有4种：1，3-二咖啡酰奎尼酸（莱蓟素）、3，4-二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸B）、3，5-二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸C）、4，5-二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸A），并且目前研究最多的是后3 种，图1为异绿原酸A、B、C的结构式。

2 异绿原酸生物活性

近年来，异绿原酸的抗炎症、抗菌、抗病毒、抗氧化、保护肝脏等生物活性已逐渐被人们所熟知[3-9]。除此之外，国外的一些研究还发现异绿原酸具有抗癌、治疗急性肺损伤、抗鞭毛虫、抑制遗传物质转录与翻译、保护代谢系统、抑制平滑肌收缩、促凝血、降血压等临床药用价值。

图1 异绿原酸A（1）、B（2）、C（3）的结构式

2.1 抗炎症

大量研究表明，异绿原酸具有良好的体内外抗炎活性。Kimura等[10]研究发现，三种不同异构体的异绿原酸能抑制人体外周血多形核白细胞A23187诱导钙离子产生白三烯B4，同时异绿原酸B 又能刺激分泌前列腺素E2，这两方面作用足以表明异绿原酸具有良好的抗炎活性。杨敏[11]对佐剂关节炎小鼠进行动物实验研究，发现分离自苦丁茶中的异绿原酸类化合物对类风湿性关节炎具有良好的治疗效果。侯彩平[12]利用LPS诱导的炎症状态下斑马鱼模型，证明异绿原酸A能降低斑马鱼体内一氧化氮和活性氧的产生，缓解卵黄囊水肿和降低斑马鱼心率，此作用具有浓度依赖性。异绿原酸A在实验浓度范围（5～40 pg/mL）内能使CuSO4诱导的斑马鱼体内测线巨噬细胞数减少，且减少的数量随异绿原酸A浓度的升高而增多。倪付勇等[13]的研究发现，异绿原酸A和异绿原酸C能抑制白细胞迁移和超氧阴离子产生的炎症过程，具有良好的体外抗炎作用。

2.2 抗菌

异绿原酸对细菌和真菌均具有一定的抑制效果。从结构上来看，异绿原酸比绿原酸更对称，极性更小，且包含两个咖啡酰基，使其有更多羟基，因此可以推测，异绿原酸比绿原酸破坏细菌细胞壁、膜结构的能力更强，抑菌效果更好。周志娥等[14]发现绿原酸和异绿原酸A 对大肠杆菌的抑制作用强于苯甲酸钠和山梨酸钾。杨岸奇等[15]发现绿原酸对一些真菌也有抑制作用，如新生隐球菌、念珠菌和烟曲霉。当绿原酸奎宁基团上的羟基与游离氨基结合时，对真菌的抑制作用更强。李更森[16]发现，异绿原酸可以降低体外构建的野生型铜绿假单胞菌-烟曲霉混合生物膜细胞外基质的产生。异绿原酸与两性霉素B+美罗培南联合应用，可明显提高混合生物膜内烟曲霉菌和铜绿假单胞菌的杀灭效果，即对真菌及细菌的杀灭均具有显著的协同作用。罗劲等[17]发现异绿原酸在体外不能杀死烟曲霉生物被膜内菌体，但可对烟曲霉早期和成熟期生物被膜有破坏作用，其作用呈浓度依赖性。张瑾钰等[18]通过在体外复制烟曲霉的生物膜模型，证明了异绿原酸对体外烟曲霉生物膜形成有抑制作用，因此具有一定的抗真菌活性。

2.3 抗病毒

虽然许多文献中均提到异绿原酸具有抗病毒活性，但通过实验证明异绿原酸抗病毒作用的文献依然较少。有研究表明，绿原酸类物质可以通过增强DNA自我保护来抑制HBV病毒感染，这对乙型肝炎病毒的体内复制具有很好的阻碍作用。在此基础上，杨岸奇等[15]的研究表明，起抗HBV病毒作用的绿原酸类物质主要是异绿原酸C和异绿原酸A。付运星[19]建立了犬瘟热病毒感染犬肾细胞(MDCK)模型，证明了异绿原酸A可以通过影响TLR3信号通路，在体外成功抵抗犬瘟热病毒感染，但无法对犬瘟热病毒进行进一步灭活以及无法预防犬瘟热病毒对动物机体的感染，即异绿原酸A可以作为潜在抗犬瘟热病毒的物质。Cao等[20]等通过建立细胞和动物模型，证实食品中提取的抗氧化剂异绿原酸C可通过调节谷胱甘肽的氧化还原稳态，防止肠病毒71（ev71）感染，从而体现异绿原酸C 的抗病毒作用。另外，美国加州大学Robinson等[21]研究发现，异绿原酸A不仅抑制能HIV-1整合酶的活性，还能阻碍HIV-1病毒在组织中的复制过程，其治疗指数高于100。

2.4 抗氧化

由于异绿原酸与绿原酸在结构上很相似，所以同样具有良好的体内外抗氧化活性。侯彩平[12]采用DPPH法、水杨酸比色法、邻苯三酚自氧化法及还原力测定法来进行体外抗氧化实验,利用皮肤荧光斑马鱼模型研究异绿原酸的体内抗氧化活性。结果表明，异绿原酸A对自由基有较好的清除能力，有良好的体内体外抗氧化活性，并且发现随着异绿原酸A浓度的增加，其相对抗氧化能力逐渐下降。杨岸奇等[15]建立了四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤模型，并对其原位及其t-BOOH介导的心脏和肝脏匀浆进行化学发光实验，证明绿原酸的几种同分异构体均具有一定的抗氧化作用。Iwai等[22]通过实验证明异绿原酸C是绿咖啡豆7种咖啡酰奎宁酸类化合物中抗氧化活性最好的。还有研究表明，3,5-二咖啡酰奎宁酸通过激活pi3k/akt 信号通路保护h9c2心肌细胞免受氧化应激诱导的凋亡[23]。Xia等[24]将化学分析和生物活性鉴定相结合，用DPPH、ABTS等自由基清除实验得出艾蒿中的绿原酸、异绿原酸B、A、C、麦角酰二醇、乙酰西丁和尤帕替林等成分具有较强的抗氧化活性。Liu等[25]用DPPH自由基清除活性测定法评价50%金银花甲醇提取物抗氧化活性。结果表明，该提取物的抗氧化活性与指纹图谱中的异绿原酸B、异绿原酸C、异绿原酸A及木犀草苷四峰密切相关。

2.5 增强肝功能及保肝护肝

近年来，国内外的学者在异绿原酸类物质对增强肝功能代谢及其保护作用方面研究较多。杨岸奇等[15]在其研究中发现，异绿原酸类物质能修复由巨噬细胞和氯仿引起的肝损伤，并通过实验发现囊吾提取物异绿原酸B可以缓解肝脏脂肪过氧化的过程，同时还发现10 μg/mL 的异绿原酸B 溶液的250 μg/mL 囊吾提取物溶液与对于降低由乙酰氨基酚注射引起的肝脏脂肪代谢障碍具有相当的效果。Hao等[26]发现异绿原酸具有抗乙型肝炎作用，主要体现在：异绿原酸A的抗氧化性能和诱导细胞中血红素氧合酶-1 可以达到对肝的保护作用。发现异绿原酸B能抑制氧化应激，通过特定的信号通路抑制多种成纤维因子，对非酒精性脂肪性肝炎纤维化有显著的保护作用。

特别是中国医学科学院刘鑫团队，连续多次使用异绿原酸B 或C 对四氯化碳引起的小鼠肝损伤模型进行研究，最终发现其相关信号通路，对肝炎纤维化的治疗具有一定的临床指导意义。2017年，刘鑫等[27]发现异绿原酸B(ICAB)对四氯化碳(CCl4)引起的小鼠急性肝损伤具有明显地保肝降酶作用，其作用机制可能与参与调节其肝细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路、缓解氧化应激相关。并且异绿原酸B在抗神经退行性疾病方面优于绿原酸也已被证实，这可能是因为异绿原酸B有更多的酚羟基。2019年，Liu等[28]又通过实验证实，分离自兔耳草的异绿原酸B能通过Nrf2 抑制氧化应激和通过mir-122/hif-1 信号通路抑制多种促纤维化因子，对非酒精性脂肪性肝炎的纤维化有显著的保护作用。2020 年，Liu 等[29]的研究再次表明从紫菀中分离得到的异绿原酸A 可能通过抑制hmgb1/tlr4/nf-kappa 信号通路，来抵抗CCl4诱导的肝纤维化。

2.6 抗癌

异绿原酸类物质对某些癌症具有一定的治疗或辅助治疗的作用。Yu 等[30]研究了金银花提取物异绿原酸C 抑制三阴性乳腺癌细胞系(tnbc) mda-mb-231(egfr)水平升高的分子机制，发现了异绿原酸C(icac)对表皮生长因子受体(egfr)诱导的上皮-间质转化(emt)和mda-mb-231 细胞侵袭的抑制作用依赖于egfr/磷脂酶c(plc)/extracellular regulated protein kinase 1(erk1)/slug信号通路的结论。此结论可以为下一步治疗tnbc的策略提供线索。杨岸奇等[15]将其对绿原酸及其衍生物(包括异绿原酸)在加强抗癌药物作用效果方面的研究开发成了专利，并阐明了其机理是绿原酸及其衍生物可增强癌细胞对抗癌药物的敏感程度，从而使抗癌药物能更好地发挥疗效。

2.7 治疗急性肺损伤

Wang等[31]研究表明异绿原酸A对LPS诱导的nfb/nlrp3信号通路的蛋白质表达有抑制作用，可逆转LPS诱导的急性肺损伤的作用，是治疗急性肺损伤的有前途的单体，为今后急性肺损伤的治疗研究提供参考。

2.8 平滑肌抑制作用

异绿原酸类物质对平滑肌抑制作用体现在能解除支气管平滑肌痉挛和抑制消化道平滑肌收缩。杨岸奇等[15]分别利用电流和乙酰胆碱刺激豚鼠回肠，发现异绿原酸类物质对抑制回肠平滑肌收缩有一定的抑制作用，且此作用与罂粟碱作用相似。

2.9 抗鞭毛虫

Zhang 等[32]研究表明，从艾蒿及其酯类衍生物中分离得到的3,5-二咖啡酰奎宁酸具有抗蓝氏贾第鞭毛虫的亮氨酸合成酶和潜在的抗贾第鞭毛虫作用。

2.10 其他作用

张琼光等[33]证明，苦丁茶中异绿原酸部位能显著改善实验性2 型糖尿病小鼠的糖脂代谢紊乱。汤洁等[34]发现金银花中的绿原酸、异绿原酸具有参与人体血小板凝集和凝血因子的生成等作用。Oh 等[35]研究表明596 μmol/L 的异绿原酸A 和534 μmol/L 的异绿原酸C具有抑制血管紧张素转换酶的活性，这表明异绿原酸类化合物可能具有降低血压的作用。

3 异绿原酸提取工艺

文献调研发现，异绿原酸类化合物主要来源于金银花、苦丁茶、甜叶菊、艾蒿、兔耳草、丁公藤等天然植物。近年来，针对不同天然植物来源的异绿原酸，研究学者们分别开发了如热回流提取法、大孔树脂吸附法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解等提取方法。但相对于绿原酸来说，异绿原酸的提取工艺研究依然较少。

异绿原酸类化合物极性较大，一般需要选用水、甲醇、乙醇等大极性的提取溶剂进行提取。Scharlack等[36]发现，使用醇溶剂浸取得到的绿原酸类化合物具有较好的稳定性，若同时采用超声辅助浸取可提高该类化合物的得率。倪付勇等[13]首先对金银花用70%的乙醇进行提取，提取液再用大孔树脂吸附法进行分离和富集，最后利用制备色谱制备出高含量的咖啡酰奎宁酸类化合物，此举可经济、快速、有效地得到异绿原酸A、B、C，为金银花中异绿原酸类化合物的分离开辟了新思路。杨敏[11]设计了正交试验对苦丁茶中异绿原酸水提取工艺进行条件优化，并采用高效液相色谱测定各工艺参数下得到的异绿原酸总含量。最终优化出的提取工艺能将总异绿原酸的含量提高到82.30%。汪爱国等[37]采用自制螺旋管分馏萃取装置连续萃取分离了金银花粗粉中的绿原酸和总分异绿原酸。以水为流动相，乙酸乙酯为固定相，每个循环周期泵入原料液20 mL，流动相50 mL，反推固定相40 mL在该条件下，绿原酸和总分异绿原酸分离完全，最终得到总分异绿原酸干燥产品，纯度为82.3%，回收率为90%。由于该套设备结构简单，操作简便，连续制备量可达数千克每日，因此有利于工业化放大，可同时完成多级逆流萃取、分馏萃取和色谱洗脱等多种分离手段。

Sun等[38]采用高速逆流色谱(hsccc)和液-液萃取相结合的方法，成功地从中药材中分离出异绿原酸A和异绿原酸B。以乙酸乙酯和-己烷-乙酸乙酯-水(3∶3∶4和1∶5∶4，V/V/V)为液-液萃取溶剂体系，去除混合物中的高、低极性杂质。60 g的乙醇提取物经溶剂分配精制得到1.7 g的富集部分，其中480 mg的异绿原酸A (纯度98.3%)52.5 mg和37.6 mg的异绿原酸B(纯度96.2%)。Qiu等[39]采用酶微反应器与高效液相色谱相结合的方法，建立了一种在线筛选方法。并用该在线筛选系统从金银花叶片中分离得到3个化合物，分别为异绿原酸B、1,5-二咖啡酰奎宁酸和异绿原酸C。该方法对中草药中葡萄糖苷酶抑制剂的快速实时捕获具有很大的潜力。Jiang等[40]开发了一种以离子液体为基础的超声波辅助提取技术(il-uae)，该技术是一种可持续地从杭白菊中提取和分离异绿原酸C的新方法。

4 异绿原酸含量检测

由于异绿原酸的含量检测一般需要多种对照品，并且异绿原酸对照品价格比较昂贵，所以除了少量研究是开发单个异绿原酸的检测方法外，目前主流的检测方法为王智民等[41]提出的一测多评的多指标质控模式。

甘玉等[42]以乙腈-0.1%磷酸(20∶80)为流动相，采用高效液相色谱仪和紫外检测器对金银花中异绿原酸A的含量进行测定。结果表明，在9.6～96 μg/mL范围内，异绿原酸A 浓度和峰面积的线性关系良好，异绿 原 酸A 的 平 均 回 收 率 为102.07%(n=6)，RSD 为1.02%。该方法符合方法学考察的规定，可作为金银花醇提液中异绿原酸A单个含量测定的方法。

付晓等[43]建立了同时测定甜叶菊中绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C三种化合物的HPLC分析方法，并完成了此3 种化合物在根、茎、叶中的含量测定。结果表明该方法准确度高，重复性好，可用于同时检测甜叶菊中3种异绿原酸类化合物。陈嘉媛等[44]建立了驱虫斑鸠菊中异绿原酸A 和异绿原酸C 含量的同时检测方法，该方法采用Shim-pack VP-ODS C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液（13.5∶13.5∶73）为流动相，流速为1 mL/min，柱温35 ℃，检测波长323 nm，进样量10 μL。结果证明该方法可用于同时检测驱虫斑鸠菊中异绿原酸A 和异绿原酸C的含量，并可为鉴定驱虫斑鸠菊的药材质量提供帮助。张民达等[45]建立了一种同时测定甜叶菊原料中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C等6种绿原酸类化合物的HPLC分析方法。此一测多评法以绿原酸为内标，采用斜率校正法建立其与甜叶菊中其他5 种绿原酸类化合物及槲皮苷在相同条件下的相对校正因子，以此求得这几种物质的含量，并同时采用外标法进行同步验证。结果表明此一测多评法准确性高，与外标法所得结果无显著差异，可用于甜叶菊原料药材的质量控制。印酬等[46]建立了测定山银花中新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C含量的HPLC分析方法，并用其观察了贵州不同产地的10 批山银花中的4 种异绿原酸的含量。徐小昆等[47]采用高效液相色谱方法对丁公藤属植物中东莨菪苷、东莨菪素、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C等6种有效成分含量进行同时测定，结果表明该一测多评法分离效果较好，简便可行，适用于丁公藤类药材的质量控制。

除此之外，特征图谱已经在中药材及其提取物方面有了广泛的应用，也可作为中药材及其提取物在溯源上的质量检验指标。因此，异绿原酸在质量控制方面亦可采用特征图谱，从源头控制其产品优质、安全、无公害，并保障其产品的可控性、规范化。