■乔君毅 任继武 樊瑞泉 员世宇

（山西农业大学经济作物研究所，山西太原030000）

豆渣是生产豆腐等豆制品的副产品，营养丰富，富含有利于畜禽生长的膳食纤维、维生素B1、微量元素等，是良好的蛋白饲料来源[1-2]。但是，由于豆渣含水量过高(80%左右)[3]，不易贮存，处理不及时而酸败发臭，容易造成环境污染。此外，豆渣含有胰蛋白酶抑制素、致甲状腺肿素、凝血素等抗营养因子影响其适口性和动物消化，不适合直接作为饲料[4-5]。此外,受人多地少、人增地减的基本国情制约，蛋白饲料短缺已成为制约我国畜牧业生产的主要问题，迫切需要开发非粮食类的饲料资源。通过将农副废弃物发酵生产蛋白饲料是解决蛋白饲料短缺问题的有效途径，受到我国研究人员的普遍关注[6]。因此，通过将豆渣微生物发酵转化为发酵饲料，不但可以改善其适口性，而且对改善生态环境、解决蛋白饲料资源短缺等具有现实意义。

张文佳等[7]通过白地霉和产朊假丝酵母混合发酵豆渣，改善了其适口性并提高了贮存性能。张永根等[8]利用乳酸菌和枯草芽孢杆菌混合固态发酵，降低了豆渣pH，提高了其贮存性能。辜澜涛等[9]利用乳酸菌、酵母菌和枯草杆菌固态发酵豆渣，发酵产物中粗蛋白质含量比发酵前提高了42%。莫重文[10]以米曲霉、黑曲霉和啤酒酵母为菌种，固态发酵豆渣，结果发现，发酵产物中粗蛋白质含量可以达到29.76%，比发酵前提高了43.07%。

通常影响豆渣发酵生产菌体蛋白饲料的因素分为培养料的因素和生产工艺的因素，前人主要集中于生产工艺因素的研究，对培养料因素的研究甚少。因此，本试验选用三种菌株固态发酵豆渣，通过研究初始含水量、pH值、氮源以及辅料对发酵产物中营养成分的影响，目的在于保留豆渣原有的优质营养物质的基础上，粗蛋白质含量有所提高，改善其在动物肠道中的消化率，并且最大程度地提高豆渣的适口性，同时为豆渣饲料化生产应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉(Aspergill usniger)和产朊假丝酵母(Cadidautilis)由山西农业大学畜牧微生物实验室提供，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由中国食品发酵工业研究所提供。

1.2 常规培养基

黑曲霉保存采用PDA 培养基，种子培养采用察氏培养基[11]；酿酒酵母、产朊假丝酵母保存采用麦芽汁琼脂培养基，液体种子液培养采用PYG 培养基[11]。

1.3 黑曲霉孢子悬液制备

已培养好的黑曲霉孢子斜面一支，加入10 mL无菌水，洗脱下孢子，制成孢子悬液并用无菌水调整孢子浓度为3×108CFU/mL备用。

1.4 酵母菌培养液的准备

酵母菌在PYG 液体培养基中培养，当达到生长对数期时，测定液体培养液中的酵母菌细胞数，然后用无菌水稀释到细胞浓度为3×108CFU/mL备用。

1.5 接种液的准备

分别取100 mL 黑曲霉孢子悬液、酿酒酵母培养液以及产朊假丝酵母培养液混合，制成细胞（孢子）浓度为108CFU/mL的混悬液备用。

1.6 原料及处理

鲜豆渣取初始含水率80%～90%，80 ℃烘干，备用。麸皮购自太谷面粉厂。

1.7 无氮平板培养基

豆渣80 g、麸皮20 g、葡萄糖10 g、KH2PO42 g、硫酸镁1 g、水1 000 mL、琼脂20 g，121 ℃、0.1 MPa灭菌30 min。

1.8 混菌固态发酵培养基配方的筛选

1.8.1 培养基不同初始含水量的选择

按照豆渣∶麸皮=4∶1（干重比，豆渣、麸皮和水分总和为100%），添加KH2PO4、氯化钠、硫酸镁、葡萄糖、硫酸铵、尿素，分别占豆渣和麸皮总量的2%、1%、0.5%、2%、0.2%和2%，含水量分为30%、40%、50%、60%、70%和80%共6 个水平，将发酵料充分搅拌，混合均匀，以40 g 的瓶装量装到罐头瓶中，然后接种液按10%的接种量（体积/质量）接入到发酵料中，于28～30 ℃恒温箱中培养96 h，分析测定其粗蛋白质含量、蛋白酶活力和纤维素酶活力。

1.8.2 pH值的确定

为了确定不同的pH 值对发酵产物的影响，本试验使用冰醋酸和氢氧化钠溶液调节固态发酵料中的酸碱度，并将其分为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5共6个水平进行试验，培养96 h，分析测定其粗蛋白质含量、蛋白酶活力和纤维素酶活力。

1.8.3 氮源的选择

选择尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸镁和硝酸钠为试验氮源。在接种混合菌种组合的无氮平板培养基的不同位置点上不同的氮源，每一个平板点一种氮源，每一种氮源三个平板。观察并测定生长圈直径，筛选出生长圈直径大的氮源，然后将筛选出来的氮源分为几个不同的添加水平，通过生长圈测定进一步试验，最后，通过固态发酵试验确定不同氮源之间的比例。

1.8.4 辅料的筛选

按照豆渣∶麸皮∶辅料=8∶1∶1（干重比，料和水分总和为100%），在上述确定的含水量、pH值和氮源的基础上，再添加KH2PO4、NaCl、硫酸镁和葡萄糖，分别占料的2%、1%、0.5%和2%，选择肉粉、豆粕、鱼粉、酒精粉、棉粕、玉米秸秆、醋糟、玉米粉和麸皮作为9种辅料，将发酵料充分搅拌，混合均匀，培养96 h，分别测定发酵产物的粗蛋白相对提高率、纤维素酶活力和蛋白酶活力。

1.8.5 培养基组成的优化

在单因素试验的基础上，设计了四因素、三水平L9（34）正交试验，分别考察了初始含水量（因素A）、pH值（因素B）、含氮量（因素C）和硫酸铵与尿素的比例（N/N，因素D）对发酵产物的影响主次和最优组合。发酵条件为：豆渣∶麸皮∶醋糟=8∶1∶1，接种量10%，接种比例1∶1∶1，瓶装量40 g，28～30 ℃恒温培养96 h，65 ℃干燥，粉碎后测定发酵产物中粗蛋白质含量。

1.9 分析方法

粗蛋白测定：采用微量凯氏定氮法（GB/T 14771—1993）[12]；纤维素酶活力的测定：CMC（羧甲基纤维素）法[13]；蛋白酶活力的测定：根据董晓燕[14]方法测定。

1.10 统计学分析

采用SPSS17.0 进行方差分析和多重比较。结果用“平均数±标准差”来表示。

2 结果与分析

2.1 不同初始含水量对发酵产物的影响

对于固态发酵，发酵料的初始含水量是影响微生物生长和繁殖的一个重要因素，它直接影响到发酵产物的利用价值，结果见图1和图2。

图1 不同初始含水量对发酵产物粗蛋白质含量的影响

图2 不同初始含水量对发酵产物纤维素酶活力和蛋白酶活力的影响

由图1可知，随着初始含水量的增加，发酵产物中粗蛋白质含量逐渐增加，当初始水分含量为60%时，粗蛋白质含量最高，达到27.61%，然后，随着初始含水量的增加，粗蛋白质含量逐渐减少。初始含水量为50%和60%时，粗蛋白质含量差异并不显著（P＞0.05）。

由图2 可以看出，随着初始含水量的增加，纤维素酶活力和蛋白酶活力逐渐增加，水分含量达到50%时，纤维素酶活力和蛋白酶活力最大，分别为131.75 U/g 和31.55 U/g，水分含量大于50%时，纤维素酶活力和蛋白酶活力随着水分含量的增加而下降。

2.2 初始pH值对发酵产物的影响

发酵料中的初始pH值影响菌种对环境的适应速度、细胞内酶的活性生长繁殖以及其蛋白质的积累。本试验按照1.8.1的方法，初始含水量50%，进行固态发酵，结果见图3和图4。

从图3中可以看出，在酸性环境中发酵出来的发酵产物，其粗蛋白质含量高于在碱性环境中发酵出来的发酵产物，在pH 值等于5.5 时，粗蛋白质含量达到最高水平，可以达到27.05%。

图3 不同pH值对发酵产物粗蛋白质含量的影响

图4 不同pH值对发酵产物纤维素酶和蛋白酶活力的影响

由图4可知，pH值4.5时，发酵产物中的纤维素酶活力最高，其次是pH 值5.5 时的发酵产物，但二者的差异并不显著（P＞0.05）；pH 值5.5 时，发酵产物中的蛋白酶活力最高，达到了32.89 U/g。

2.3 无机氮源的研究

2.3.1 生长圈测定试验

在接种有混合菌种的无氮平板培养基上，在不同位置点上用不同的氮源进行培养，观察并测定菌种的生长圈直径，测定结果见表1。

表1 不同氮源对生长圈直径的影响（mm）

表1结果表明，混菌种同化硝酸钠和硝酸镁的能力很小，但能很好地利用尿素、硫酸铵，且硫酸铵对混菌种的作用效果最好，尿素次之。

2.3.2 不同浓度的尿素、硫酸铵的比较试验

为验证对混合菌种有作用的两种氮源（尿素和硫酸铵）的浓度对混合菌种生长效果的影响，进行了对比试验，结果见表2。

由表2 测定结果可以看出，对于每一种氮源，随着添加量的增加，菌种在无氮平板培养基上的生长圈直径逐渐增大，说明增加各种氮源浓度有利于混合菌种的生长繁殖。但当尿素浓度增加到3.21%、硫酸铵浓度增加到7.70%以上时，约相当含氮量1.5%时，其生长圈直径增大不再明显。

从表1和表2结果可知，本试验的菌种组合适宜的环境是酸性环境，硫酸铵虽然是生理酸性物质，但价格比较高，没有尿素经济，同时硫酸铵含氮量低，过量使用会使硫酸根离子过多，不利于发酵。综合以上试验结果，选择尿素和硫酸铵作为底物发酵添加的无机氮源。

表2 不同浓度的氮源生长圈直径测定结果

2.3.3 硫酸铵、尿素比例（N/N）的确定

由于尿素是生理碱性物质，它和硫酸铵之间的比例决定了发酵料的pH值，影响菌种的生长。因此，按照初始含水量50%，pH值5.5，含氮量1.5%，硫酸铵和尿素比例（N/N）为：1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1五个水平进行试验，结果见图5、图6。

图5 不同氮源比例对发酵产物粗蛋白质含量的影响

图6 不同氮源比例对发酵产物纤维素酶活力和蛋白酶活力的影响

由图5 可知，当硫酸铵和尿素之间的比例（N/N）为2∶1 时，发酵物中的粗蛋白质含量最高，达到31.84%，当硫酸铵添加量增加时，粗蛋白含量降低，并且差异显著（P＜0.05）。

由图6 可以看出，随着硫酸铵比例的提高，发酵产物中的纤维素酶活力和蛋白酶活力逐渐增大。当比例为2∶1时，纤维素酶活力最高，但与比例为3∶1时的纤维素酶活力差异并不显著（P＞0.05）；比例为3∶1时，蛋白酶活力最大，但与比例为2∶1时蛋白酶活力相比，差异并不显著（P＞0.05）。

2.4 辅料的选择

按照初始含水量50%，pH值5.5，含氮量1.5%，硫酸铵与尿素（N/N）之间的比例为2∶1进行发酵试验，结果见表3。

由表3 可知，在发酵底物中使用不同的辅料，对粗蛋白质含量相对提高率、纤维素酶活力和蛋白酶活力都有不同程度的影响。从粗蛋白质含量相对提高率上看，大小顺序依次为：玉米粉、玉米秸秆、醋糟、麸皮、酒精粉、棉粕、豆粕、肉粉和鱼粉，但是前三者的差异并不显著（P＞0.05）。从纤维素酶活力上看，差异比较明显，其中最高的是玉米秸秆，其次为醋糟，他们都具有粗纤维含量相对较高、粗蛋白含量相对较低的特点，说明混合菌种能很好地利用纤维原料。从蛋白酶活力上看，玉米秸秆的最高，其余的差异并不明显。

2.5 最佳培养基的优化试验

以初始含水量、pH 值、含氮量、硫酸铵与尿素的比例为考察因素，粗蛋白含量为衡定指标，设计四因素三水平正交试验（见表4），确定最佳培养基的配方以及试验因素的影响顺序，分析结果见表5。

从R值分析可知影响试验结果的因素依次为C＞A＞B＞D，即对粗蛋白质含量影响因素依次为含氮量、初始含水量、pH 值和硫酸铵与尿素的比例。从K 值和实际试验结果都可以看出，A3B1C3D2发酵产物的粗蛋白质含量最高，即初始含水量为60%，pH 值为4.5，含氮量为2%，硫酸铵与尿素的比例为2∶1。

表3 不同辅料对发酵产物的影响

表4 最佳培养基正交试验因素及水平

表5 正交试验方案和结果L9（34）

3 讨论

3.1 初始含水量

水是发酵的主要媒质，直接影响微生物的生长情况[15]，因而培养料的初始含水量是决定固态发酵成功与否的关键因素之一。初始含水量应根据物料的性质（细度、持水性）、微生物的特性（需氧、兼性厌氧或厌氧）、培养室条件（温度、湿度、通风状况）等因素来决定[16]。在本试验过程中，当初始含水量小于50%时，随着含水量的增加，蛋白酶活力、纤维素酶活力、粗蛋白质含量增加。主要是因为含水量低会使微生物生长受抑制，发酵后期由于微生物生长及蒸发造成发酵物料较干，营养物质传递困难，微生物难以生长，产量降低；当初始含水量在50%～60%时，各项指标都比较高，这是因为适宜的初始含水量，一方面有助于菌体吸收培养基的营养物质和氧传递，另一方面有利于微生物代谢产物阻遏削减，促进新陈代谢，从而促进菌体的生长繁殖；当初始含水量大于60%时，各项指标随着水分的增加而降低，主要是含水量高会减少基质内气体的体积和气体交换，不利于微生物的生长[17]。这个结果与侍宝路等[18]、张文佳等[7]研究的结果略有差异，他们研究认为最佳的初始含水量为50%～70%，这主要是因为：一方面菌种的选择不一样，另一方面辅料的选择不同,因为不同的辅料的疏松性与透气性不一样。

3.2 氮源的选择

固态发酵中菌体蛋白的增加需要培养料内充足的氮源，研究表明，对于非蛋白氮源，菌种都有比较强的利用能力[19]。本试验选择了尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸镁和硝酸钠作为出发氮源，结果表明，混菌组合能比较好地利用硫酸铵和尿素，这个结果与潘红春等[20]、高磊[21]的研究结果一致。这主要是因为尿素经尿素酶作用后分解出NH3被微生物利用，硫酸铵分解为SO42-和NH4+，NH4+可以直接为菌体所利用，参与细胞内含氮化合物的合成，并且SO42-可以降低发酵物的酸碱度，抑制杂菌的污染。但是相对于尿素，硫酸铵的氮含量较低，如果只用其作为氮源的唯一来源，不能够充分满足微生物的生长需求[21]。而硝酸铵分解为NO3-和NH4+,硝酸钠和硝酸镁分解为NO3-,而微生物利用NO3-的能力很低，只能利用NH4+，因此，在生产实践中，通常以尿素和硫酸铵二者以一定的比例使用才能起到较优的发酵效果。

3.3 辅料的筛选

微生物高繁殖的基础是必须为微生物提供足够的营养成分，尤其是碳源和氮源的提供，使得微生物的生长和产物形成的潜力得到充分发挥。固体发酵的原料一般包括两大类，一类为发酵基质，另一类为辅料[22]。本试验以豆渣为发酵基质，辅料即为改善和提高培养基中碳和氮比例的营养填充物质。本研究选用了肉粉、豆粕、鱼粉、棉粕、酒精粉、玉米秸秆、醋糟、玉米粉和麸皮9 种物质作为辅料，添加到豆渣中进行混合菌微生物固体发酵，从粗蛋白质含量提高率、纤维素酶活力和蛋白酶活力综合指标上来看，玉米秸秆以及醋糟作为辅料的效果比较好，这可能是与这两种物质含有的纤维素含量比较高有关，高纤维辅料一方面可能弥补了菌种生长的碳氮比[23]，另一方面改善了发酵物中的通透性。此外，在实际生产中，选择辅料除了改善产物中的营养成分外，还应该考虑易获得性和成本等因素。山西省是一个醋糟资源比较丰富的省份，据统计，近几年年产量达60 多万吨，几乎占全国总量的1/4[24],而且醋糟的价格比较便宜，使用其不但不影响发酵产物的品质，而且利用了其资源，保护了环境。因此，本试验选择醋糟作为辅料。

3.4 pH的选择

初始pH值是影响混菌固态发酵豆渣的重要因素之一，pH 值一般通过影响菌体细胞膜上的电荷性质来影响其对营养物质的吸收，进而影响混菌的发酵效果。在本试验中，当初始pH值在4.0～6.0时发酵效果比较好，这与李思聪[25]、潘天玲等[26]报道的结果相似。

4 结论

本试验主要是研究了固态发酵的初始含水量、pH 值、氮源以及辅料对豆渣发酵结果的影响，通过测定发酵产物中的粗蛋白质含量、蛋白酶活力和纤维素酶活力，从而确定出豆渣固态发酵的最佳培养料生产条件为：①豆渣∶麸皮∶醋糟=8∶1∶1；②初始含水量为60%；③pH 值为4.5；④含氮量为2%且硫酸铵与尿素的比例（N/N）为2∶1。