几种添加剂对矮象草青贮品质的影响

2021-05-17何晓涛陈杰茹王学梅韩蒙蒙陈韬羽杨雨辉

饲料工业 2021年8期

■何晓涛陈杰茹王坚王学梅韩蒙蒙朱昊陈韬羽杨雨辉

（海南大学动物科技学院，海南海口570228）

矮象草（Pennisetum purpereum）是一种适于红壤地区种植的优质禾本科多年生新饲草品种，生长于热带和亚热带地区。该品种由美国于20 世纪80 年代培育得到，广西首先引进，目前在我国南方地区已得到大量种植。因其分蘖多、产量高、品质好、适应性广、抗逆性强、饲喂效果好的经济效益特点，现已成为重要的饲草资源[1]。刈割的矮象草通常通过调制成干草或青贮饲料的方式保存，但南方天气潮湿多雨，矮象草茎粗且含水量高，因此不易调制为干草。而青贮不仅受天气因素影响小，还能有效保存优质多汁青草饲料，更能在一定程度上降解牧草中的纤维素含量，提升其营养价值[2]，因此多采用青贮的方式贮存矮象草。青贮是一个十分复杂的生化反应过程，有很多微生物的参与，其中起主要作用的微生物是乳酸菌，其生长和繁殖需要足够的可溶性碳水化合物用以提供必要的物质保障[3]。Monika 等[4]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌具有降解粗纤维的作用，可以将纤维素降解成还原性糖，从而增加可溶性碳水化合物，提升发酵底物的含量。纤维素酶是由多种纤维素水解酶组成的复杂酶系，可以将纤维素分解成寡糖或单糖[5]，也具有增加发酵底物含量的作用。李苏新等[6]研究发现，通过添加3%双歧乳酸杆菌增加乳酸菌含量，能有效提升矮象草青贮质量。目前，有关如何提高矮象草青贮品质的研究仍然较少，因此，本试验旨在研究添加贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和纤维素酶对矮象草青贮效果的影响，为矮象草青贮饲料的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮原料：海南省儋州市热带农业基地种植的矮象草。

青贮添加剂：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis，Vel，从白蚁肠道中筛选得到）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，Lab，由海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室筛选得到）、纤维素酶（cellulase，Ce，9012-54-8，10 000 U/g，上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

以生长10周的矮象草为原料，设置6个不同的处理组：对照（CK）组，贝莱斯芽孢杆菌（VEL，3%）组，植物乳杆菌（LAB，3%）组，贝莱斯芽孢杆菌+植物乳杆菌（VEL+LAB，1.5%+1.5%）组，纤维素酶（CE，3%）组和纤维素酶+植物乳杆菌（CE+LAB，1.5%+1.5%）组。细菌添加量为2×106CFU/g鲜草，纤维素酶添加量为30 U/g鲜草，将菌液和纤维素酶分别稀释到6.7×107CFU/mL和1 000 U/mL，3%添加量即为30 mL/kg，1.5%的添加量即为15 mL/kg。青贮30 d，分别在青贮2、4、8、12、20、28 d后，开启封装袋取样分析。每组3个重复[7-8]。

1.2.2 青贮饲料的调制

于试验前1 d的18：00刈割矮象草，过夜晾干，将其切碎成长度2～3 cm大小，并混匀均分成6组，第1组作为空白对照组，加入30 mL/kg 的纯化水，其他5 组分别按比例加入2×106CFU/g 的菌液和30 U/g 鲜草的纤维素酶，混匀，取180 g 装进聚乙烯真空塑料袋（20 cm×30 cm）中，并用真空抽气封口机排气封口[9-10]。

1.2.3 感官鉴定

根据青贮饲料品质评分表（见表1），参照GB/T 10220—2012/ISO 6658：2005《感官分析方法学总论》对样品的水分、色泽、质地和气味进行分数统计，初步判定矮象草青贮效果。

1.2.4 微生物计数

1.2.4.1 Vel计数

使用CMC-Na 固体培养基，配制好的培养基经121 ℃高压灭菌后倒入直径90 mm 培养皿中制成CMC-Na琼脂平板，密封室温放置1～3 d，确保无污染。采用五点取样法取20 g青贮饲料样品放在180 mL生理盐水中，在室温条件下以180 r/min 的转速振荡浸泡2 h，得到浸泡液；取均匀浸泡液1 mL，置于10 mL的无菌试管中进行梯度稀释，稀释10～107倍，取20 μL点滴在平板上，37 ℃培养18 h计数。

表1 感官鉴定评分

1.2.4.2 Lab计数[11]

使用MRS 固体培养基，倒入直径90 mm 培养皿中制成MRS 琼脂平板，密封室温放置1～3 d，确保无污染。取均匀浸泡液1 mL，置于10 mL的无菌试管中进行梯度稀释，稀释10～107倍，取20 μL 点滴在平板上，35 ℃厌氧培养18 h计数。

1.2.5 质量指标和营养指标的测定

采用五点取样法，取20 g 青贮饲料样品放入70 mL纯化水中，置于4 ℃冰箱静置浸泡24 h，用滤纸过滤2遍，得到滤液，分装为两份，其中一份滤液A用来测定青贮饲料样品的pH值[12]、氨态氮(ammonia-N，NH3-N，苯酚-次氯酸钠法[13])、可溶性碳水化合物(Water soluable carbohydrate，WSC，蒽酮-硫酸法[14])；将另一份滤液经高速冷冻离心机（Centrifuge 5810 R，Eppendorf）于10 000 r/min 离心5 min，取上清液再经过0.25 μm 孔径的有机滤膜过滤得到滤液B，采用LC-20A 型（岛津，日本）高效液相色谱仪[色谱柱：型号Venusil XBP C18(2)，粒径5 μm，孔径100A，规格4.6 mm×250 mm，Agela, 中国；检测器：SPDM20A；流动相：1 mmol/L 磷酸二氢钠溶液、甲醇；流速：1.0 mL/min；柱温：26 ℃；检测波长：217 nm；进样量：10 μL]测定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）与丁酸（Butyric acid，BA）等有机酸含量（GB 5009.157—2016）。

将剩余样品烘干粉碎，得到固体粉末，计算含水量，粉末过40 目筛后可用于测粗蛋白质（Crude protein，CP，凯氏定氮法[15]）、中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（Acid detergent fiber，ADF，Van Soset分析法[16]）含量。

1.2.6 数据统计与分析

使用SPSS 23.0 软件对数据进行分析，采用Duncan’s分析进行多重比较，分析各组数据的差异显著性，数据采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 发酵品质

2.1.1 感官鉴定(见表2)

表2 感官鉴定结果

经过添加剂处理后，青贮的矮象草在色泽上能更大程度地保留原本的颜色，其中VEL 组、LAB 组和VEL+LAB组的颜色最好；质地上也有所改善，相比对照组都未出现黏手现象；气味上可闻出对照组有轻微腐败的味道，CE 组和CE+LAB 组为正常酸味，而VEL组、LAB组和VEL+LAB组不仅有发酵的酸味，还带有一点特殊的麦芽糖香味。因此，由感官鉴定可初步判断，经过添加剂处理后，矮象草的青贮质量得到了提高，其中VEL+LAB组的青贮效果最好。

2.1.2 Vel和Lab浓度(见图1)

由图1a和图1b所示，各组Vel和Lab数量的变化趋势相同，分别在第12 d和第8 d时达到最大，之后逐渐减少，Vel在第28 d最少，Lab在第20 d达到最小值后，部分处理组出现了数量略微增加的现象，推测是对应组出现了轻微漏气所致。

2.1.3 pH值(见图2)

图1 不同处理组在不同青贮天数时Vel（a）和Lab（b）的数量统计

图2 不同处理组在不同青贮天数时的pH值

如图2 所示，VEL+LAB 组的pH 值降低速度最快且能达到较低的pH值，在第8 d达到最低pH值，能尽快抑制饲料中腐败菌的活动，减少营养物质的流失。较低的pH值更容易保持青贮饲料的稳定性，12 d后青贮饲料pH值出现一定程度的回升，稳定性变差，但相比对照组，试验组的稳定性得到了显著性的提升。

2.1.4 NH3-N的浓度(见图3)

如图3 所示，随着青贮时间的增加，处理组的NH3-N浓度整体呈增加趋势，这与营养蛋白质的降解损耗有关；相比对照组，试验组在青贮过程中基本都能保持较低浓度的NH3-N，其中VEL+LAB 组在28 d时浓度最低，其次是LAB组和CE组，均与对照组差异极显著(P＜0.01)，说明其减少了蛋白质的损耗。

2.1.5 有机酸的含量(见表3～表6)

如表3～表6 所示，CK 组和VEL 组在12 d 时乳酸含量达到最大，但VEL 组比CK 组乳酸积累的速度更快，其他处理组乳酸含量积累速度均有所提升，且在第8 d 时达到最大；乙酸积累相比乳酸会有一些滞后性，因为青贮过程中有一部分乳酸会转化为乙酸；CK组和CE 组的丙酸含量在第28 d 时最大，VEL 组和LAB组在第20 d达到最大，VEL+LAB组和CE+LAB组在第12 d达到最大，随后呈缓慢降低的趋势；在整个青贮过程中，CK组在4、8、28 d均检测到丁酸，VEL+LAB组未检测到丁酸，VEL组、LAB组和VEL+LAB组有所改善，CE 组在12 d 和20 d 时检测到较多的丁酸。说明除了CE组，其他处理组青贮质量均有所改善。

图3 不同处理组在不同青贮天数时NH3-N的浓度

2.2 营养成分

2.2.1 WSC含量(见图4)

如图4所示，所有处理组的WSC浓度都随着青贮时间的增加而减少，这与青贮饲料中微生物的活动有关，WSC为微生物提供了能量和营养物质。第4 d时VEL组的WSC浓度最高，CE组和CE+LAB组最低，可能是因为相比于Ce的直接作用，Vel需要增殖到一定浓度时才能对纤维素的分解达到较快的速度，而Vel的增殖需要时间，因此VEL组的WSC含量大量减少的过程比CE组和CE+LAB组滞后；随着发酵时间的延长，可溶性碳水化合物被大量消耗，最后达到一个相对稳定的状态。

表3 不同处理组在不同青贮天数时发酵液中乳酸的含量(mg/mL)

表4 不同处理组在不同青贮天数时发酵液中乙酸的含量(mg/mL)

表5 不同处理组在不同青贮天数时发酵液中丙酸的含量(mg/mL)

表6 不同处理组在不同青贮天数时发酵液中丁酸的含量(mg/mL)

图4 不同处理组在不同青贮天数时WSC的浓度

2.2.2 CP含量(见表7)

如表7所示，青贮20 d内粗蛋白质含量呈缓慢减少的趋势，但各组无显著性差异，到第28 d 时青贮饲料稳定性变差，微生物开始活动，粗蛋白质含量降解速度加快，其中CE+LAB 组、CE组和CK组降解最多，呈显著性差异；VEL+LAB 组降解最少，无显著性差异，这可能是因为青贮时形成较低pH 的环境能更好地抑制了微生物的活动。

2.2.3 NDF含量(见表8)

如表8 所示，青贮后CK 组、VEL 组、VEL+LAB 组和CE组NDF 降解较少，无显著性差异；到第28 d时，LAB 组和CE+LAB 组降解较多，呈显著性差异。与CK 组相比，CE 组和CE+LAB 组NDF 降解较多，呈显著性差异。这一定程度上反映了添加Lab 对NDF 降解具有一定的促进作用。

2.2.4 ADF含量(见表9)

如表9 所示，青贮前后，所有处理组的ADF 含量均呈下降趋势，但CK 组和VEL 组的ADF 降解不显著，其他试验组的ADF 降解均呈显著性差异，说明添加Vel、Lab 和Ce 均对ADF 降解具有一定的促进作用。

表7 不同处理组在不同青贮天数时粗蛋白质的含量(%)

表8 不同处理组在不同青贮天数时中性洗涤纤维的含量(%)

表9 不同处理组在不同青贮天数时酸性洗涤纤维的含量(%)

3 讨论

青贮饲料的pH 值、含水量、可溶性碳水化合物、乳酸以及丁酸等都是衡量其品质的指标。阿依古丽等[17]研究发现，pH 值降低到4.2 以下可以杀死几乎所有的腐败微生物，提高青贮饲料的稳定性，延长保存时间；另一方面，青贮饲料的pH值受含水量和可溶性碳水化合物的影响，高海娟等[18]研究表明，含水量过高时梭状杆菌大量增殖，抑制乳酸菌的增殖生长，从而影响pH 值的降低，这与本试验研究结果相一致。Amer等[19]研究表明，可溶性碳水化合物是微生物增殖生长的底物，其含量过低时也会影响乳酸菌的增殖，从而导致pH 值难以降低，影响青贮饲料品质。在一定范围内，提高可溶性碳水化合物含量，有助于乳酸菌的增殖和发酵；还可通过直接添加乳酸菌来加速发酵过程，从而加速青贮饲料pH值的下降，快速抑制腐败微生物的活动，减少营养损失，本试验添加了乳酸菌的试验组青贮质量均有所提高，与前人研究相符。李改英等[20]研究表明，蛋白质分解会导致氨态氮含量的增高，丁梭酸菌的发酵会产生丁酸，优质的青贮饲料应该含有较少的氨态氮和丁酸，本试验处理组相比对照组，除CE 组外，氨态氮和丁酸含量均有所下降。本试验数据表明，直接对矮象草进行青贮的效果较差，这可能是因为矮象草茎干粗硬，青贮时难以通过挤压来排尽空气，且含水量、粗纤维含量高，可溶性碳水化合物含量低，导致青贮时难以压实和排尽空气，从而影响青贮效果；添加Lab 和Vel 均能提高青贮质量，其中将Lab和Vel混合同时添加效果最好；但是添加Ce 的处理组效果相对差一些，可能是因为此种纤维素酶对Lab具有抑制作用。

Bai 等[21]研究表明，微生物的活动或使粗蛋白质降解，而快速降低pH值可以抑制微生物的活动，使青贮尽快达到稳定期，从而减少粗蛋白质的降解。Ni等[22]研究发现，添加乳酸菌能使其在青贮前期快速增加，从而产生大量乳酸，加快pH值的降低。本试验数据表明，添加Lab和Vel使pH值降低且加速了这一过程，粗蛋白质的降解率也相应降低，保留了更多的营养物质。Uddin 等[23]研究发现，提高青贮饲料中粗纤维的降解率，有利于增加反刍动物的采食率，从而提高生产性能，本次试验各处理组的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率都有所提高，因为添加的Vel 和Ce 均具有降解粗纤维的作用。另外，Xu 等[24]研究表明，Lab也有降解粗纤维的作用，纤维素的降解能提高可溶性糖的含量，增加了乳酸菌的生长底物，加快乳酸菌的繁殖，从而使pH值快速降低，提高青贮品质。