■曹 慧 任世威 张腾月，2 秦亚宁，3 张 兰，4 杨佳萌 张朋振

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471000；2.广东海洋大学农学院，广东湛江524088；3.四川农业大学动物营养研究所，四川成都611130；4.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都610041)

植物中的结构性多糖主要是纤维素与半纤维素[1]，能将两者降解为可溶性糖的酶被称为纤维素酶和半纤维素酶[2]。纤维素酶在饲料、纺织、食品加工中均有广泛应用[3-4]。纤维素降解过程中，半纤维素酶对纤维素酶的水解效率有促进作用[5]。反刍动物饲料中含有大量的纤维素与半纤维素，但动物消化道自身不产生纤维素酶，无法直接高效利用纤维素[6]。我国早在20 世纪90 年代便开始了对饲用酶制剂的研究与应用[7]。微生物发酵产生的纤维素酶与半纤维素酶广泛应用在反刍动物饲用酶制剂中。商业酶制剂的最适作用温度普遍为60 ℃[2]，与反刍动物瘤胃的温度（39 ℃）[8]差别较大，影响纤维素酶的水解效率。因此，筛选适应低温环境的纤维素降解菌成为近年的研究热点。

青藏高原平均海拔4 000 m 以上，具有海拔高、辐射强、低温、低氧等特点，其独特的自然气候和地域特征，使得土壤微生物对青藏高原特殊生态环境产生了特有的生理适应机制[9-10]。权淑静等[11]从青藏高原土壤样品中筛选出低温条件下产蛋白酶的菌株LS20-2，被鉴定为皮氏类芽孢杆菌。谢占玲等[12]从青海湖中分离到617株耐盐真菌，首次系统研究了青海湖中耐盐真菌的多样性，展示了青海湖中丰富的耐盐真菌资源。本研究旨在通过对青藏高原土壤微生物中低温纤维素降解菌株的筛选与酶学特性研究，以期寻找新的纤维素酶资源，为高原菌种资源利用提供科学依据，为我国饲用酶制剂的研发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品

用梅花形采样法，从青藏高原冷地早熟禾草地采集土壤样品，-20 ℃保存备用。

1.1.2 主要培养基

筛选培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、琼脂17 g、纯化水1 L，pH值5.5～6.0。

纯化培养基：200 g 土豆浸出液、葡萄糖20 g、KH2PO40.02 g、MgSO4·7H2O 0.015 g、琼脂20 g、纯化水1 L，pH值5.5～6.0。

发酵培养基：CMC-Na 5 g、蛋白胨3 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、纯化水1 L，pH值5.5～6.0。

上述培养基均需121 ℃高压灭菌30 min。

1.1.3 主要试剂

CMC-Na（国药集团化学试剂有限公司）、木聚糖（自提玉米芯木聚糖，提取方法参考赵龙妹等[13]）、DNS（3，5-二硝基水杨酸，配置方法参考王明瑞等[14]）、Triton X-100基因组提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]、葡萄糖、MgSO4·7H2O（江苏强盛化工有限公司）、K2HPO4、KH2PO4（天津市凯通化学试剂有限公司）、琼脂粉（天津市大茂化学试剂厂）。

1.1.4 仪器与设备

酶标仪（Bio-Rad laboratories Inc）、高压灭菌锅、气浴恒温振荡器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、恒温水浴锅（上海科銮仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

初筛：10 g 土壤样品、90 mL 无菌水于锥形瓶中，20 ℃、200 r/min 混匀30 min，取10-2土壤稀释液200 μL均匀涂布于筛选培养基上，20 ℃培养72 h，选取单菌落纯化培养。纯化后的菌株点接种于筛选培养基，20 ℃培养72 h，用刚果红染色法[15]观察菌落透明圈，测量菌落直径（d）及透明圈直径（D），选择D/d值较大的菌株为初筛菌株。

复筛：初筛菌株接种于发酵培养基，20 ℃、200 r/min振荡培养72 h，发酵液12 000 r/min 离心10 min 制备粗酶液，进行纤维素酶活力测定，选取酶活力最大的菌株为目标菌株，并测定半纤维素酶活力。

1.2.2 纤维素酶活力的测定

0.25 mL粗酶液与0.25 mL底物（1%羧甲基纤维素钠溶液）混匀，40 ℃水浴反应30 min，立即加入0.75 mL DNS 终止反应，沸水浴显色10 min，冷却至室温，在540 nm波长下测定吸光度。

酶活力定义：在40 ℃，pH 值6 时，每分钟水解底物（1%羧甲基纤维素钠溶液）产生1 μg还原糖对应的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.3 半纤维素酶活力的测定

0.3 mL 粗酶液与0.45 mL 底物（1%木聚糖溶液）混匀，50 ℃水浴反应30 min，立即加入0.75 mL DNS终止反应，沸水浴显色10 min，冷却至室温，在540 nm波长下测定吸光度。

酶活力定义：在50 ℃，pH 值6 时，每分钟水解底物（1%木聚糖溶液）产生1 μg木糖对应的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.4 菌株鉴定

形态学鉴定：菌株于纯化培养基培养后，观察菌落与菌体形态，并进行革兰氏染色镜检观察。分子生物学鉴定：用Triton X-100 基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。参照孙佑赫等[16]的方法，用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）扩 增 菌 株16S rRNA基因序列，经琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在NCBI中进行比对。应用形态学特征和分子生物学方法[16]对目标菌株进行菌种鉴定。

1.3 酶学性质初步研究

菌株发酵液离心制备粗酶液，进行相对酶活力测定。不同温度（20、30、40、50、60 ℃）下测定纤维素酶和半纤维素酶的相对酶活力确定最适反应温度。不同pH值条件（4、5、6、7、8、9、10）测定纤维素酶和半纤维素酶的相对酶活力确定最适pH 值。测定酶的温度稳定性，在不同温度（30、40、50、60、70 ℃）下保温30 min 后测定纤维素酶和半纤维素酶相对酶活力。测定酶的pH 值稳定性，在不同pH 值（4、5、6、7、8、9、10）下保温1 h 后测定纤维素酶和半纤维素酶相对酶活力。测定浓度为10 mmol/L 的不同金属离子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+）对纤维素酶和半纤维素酶相对酶活力的影响。

1.4 产酶曲线的测定

将该菌株接种于发酵培养基，20 ℃、200 r/min振荡培养120 h，每6 h取1次，测定酶活力。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

通过菌落透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值（见图1）和酶活力大小的比较，筛选出一株低温纤维素降解菌LD19，该菌株还具有产半纤维素酶的能力。

2.2 菌株的鉴定

形态鉴定：该菌株为白色不规则圆形菌落，不透明，中央微凸，难挑取（见图2）。菌丝弯曲较细，呈丝状（见图3），初步鉴定为放线菌。

图1 菌株LD19菌落透明圈

图2 菌株LD19菌落形态

图3 菌株LD19菌丝形态

分子鉴定：该菌株与已知菌株Streptomyces clavifer的16S rDNA序列相似度为99%，确定菌株LD19为钉斑链霉菌（Streptomyces clavifer）。

2.3 酶学性质初步研究

2.3.1 酶的最适反应温度（见图4）

不同温度下测定纤维素酶相对酶活力与半纤维素酶相对酶活力，以最大相对酶活力值为100%。由图4 可知，纤维素酶最适反应温度为40 ℃，属低温纤维素酶，20～40 ℃时相对酶活力不断增大，40 ℃后相对酶活力逐渐降低；半纤维素酶最适反应温度为50 ℃，20～50 ℃时相对酶活力不断增大，50 ℃后相对酶活力迅速降低。

图4 酶的最适反应温度

2.3.2 酶的温度稳定性（见图5）

图5 酶的温度稳定性

由图5 可知，在40 ℃保温处理30 min 纤维素酶和半纤维素酶相对酶活力均达到最高。纤维素酶在30～70 ℃时仍能保持较高相对酶活力，半纤维素酶在50～70 ℃时相对酶活力仅在40%左右。

2.3.3 酶的最适反应pH值（见图6）

由图6 可知，该纤维素酶与半纤维素酶在pH 值为6时酶活力均达到最高，最适反应pH值均为6。纤维素酶在pH 值4～10 时能保持75%以上的相对酶活力，说明该纤维素酶pH 值适应范围较广。半纤维素酶在pH 值4～8 是相对酶活力维持在80%左右，pH 值大于8后相对酶活力迅速下降，说明该半纤维素酶适用于弱酸性和中性环境。

图6 酶的最适反应pH值

图7 酶的pH值稳定性

2.3.4 酶的pH值稳定性（见图7）由图7可知，该纤维素酶在pH值4～10处理1 h后仍能保持90%以上的相对酶活力，该半纤维素酶在pH值9时仍有60%以上相对酶活力，说明这两种酶在酸性和碱性环境下均有良好的耐受性。

2.3.5 不同金属离子对相对酶活力的影响（见图8）

图8 金属离子对酶的相对酶活力的影响

图8可知，不同金属离子对纤维素酶和半纤维素酶相对酶活力的影响存在明显差异，以不添加金属离子时的相对酶活力为100%。除Zn2+对纤维素酶相对酶活力具有抑制作用外，Ca2+、Mn2+、Cu2+等对纤维素酶相对酶活力都具有激活作用。Cu2+对半纤维素酶相对酶活力的激活作用最大，Na+、K+等对半纤维素酶相对酶活力具有抑制作用。

2.4 产酶曲线的测定（见图9）

图9 菌株LD19产酶曲线

由图9 可知，菌株LD19 所产纤维素酶与半纤维素酶活力在0～96 h 均呈增长趋势，102 h 时纤维素酶活力为21.6 U/mL，半纤维素酶活力为16.8 U/mL，同时达到酶活力最大值，之后酶活力开始下降。

3 讨论

纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物[17]，但其中89%左右的纤维素资源未能开发利用，不仅造成大量的资源浪费，还造成了环境污染问题[6]。微生物产酶降解纤维素具有反应条件温和、环保、高效、无污染等优点[18]，在自然界和工业生产中，纤维素的降解几乎都是通过生物降解法完成的[19]。自然界中能产生纤维素酶的微生物主要有真菌、细菌和放线菌。真菌对纤维素的降解能力比较突出，具有分泌酶系全面、酶量大、酶活力高等优点，已被应用于酶制剂生产[20]。细菌产纤维素酶具有培养简单、发酵周期短、生长速度快、耐高温等优点，许多高产纤维素酶的细菌从不同的环境分离出来并被广泛研究应用[21]。相较于真菌和细菌，放线菌生长周期较长、产量较低，所以目前对放线菌的研究相对较少。有研究表明，放线菌的耐热性和对极端环境的适应能力较强[22]。

本研究中筛选出的菌株LD19经鉴定为钉斑链霉菌（Streptomyces clavifer），能同时产纤维素酶和半纤维素酶。Meij 等[23]从野生拟南芥的根部分离出优势内生菌Streptomyces clavifer，该菌特殊的定植方式使其在根部组织中具有竞争优势。Balakrishnan 等[24]从印度尼西亚野生动物保护区土壤样品中分离出的菌株Streptomyces clavifer TBG-MNR13（MTCC4150）有较强的产纤维素酶能力。链霉菌是自然界中最丰富的放线菌，能产生多种纤维素酶与半纤维素酶[24-25]，二者在木质纤维素降解过程中起协同作用，将纤维素降解为葡萄糖，将半纤维素降解为低聚木糖、木糖和阿拉伯糖等降解产物[26]，应用于畜牧行业能降低食糜黏度、减少饲料内源损失、改善肠道内的菌群结构，从而改善畜禽生产性能，提高养分和能量的利用效率[27]。孙晓萌等[22]通过对降解木质纤维素放线菌的功能组学分析证实了放线菌对木质纤维素的降解能力及其巨大的工业应用前景。杨彬等[28]从荔枝腐叶中筛选出一株具有木质纤维素降解能力的绿木霉（Trichoderma virens），能同步分泌高效纤维素酶和木聚糖酶，具有应用于木聚糖酶和木寡糖生产的潜力。李鹏飞等[6]从绵羊粪便中分离筛选出一株能够产生高活力纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的目的菌B5，经鉴定B5菌株为链霉菌属（Streptomyces sp.），对饲料粗纤维降解效率与酶活力显著相关。李师翁等[29]从青藏高原采集的牦牛粪中分离得到一株产低温纤维素酶能力较强的放线菌，初步鉴定为链霉菌属。

菌株LD19不仅能同时产生纤维素酶和半纤维素酶，而且所产纤维素酶的最适反应温度与pH 值和反刍动物瘤胃条件相似，酶的温度稳定性与pH 值稳定性较好，增加了该菌在实际生产中的应用性。研究发现[30-32]，将纤维素酶与半纤维素酶结合应用到反刍动物饲粮中，可以提高饲料利用效率，改善动物生产性能，所以该菌株在饲用酶制剂中有较大的应用潜力。但是将该菌株所产纤维素酶与半纤维素酶作为饲用酶制剂应用于反刍动物的实际生产中还须做很多工作，饲用酶制剂的添加方式、添加量、添加时间等都有待进一步的研究。

4 结论

本研究从青藏高原冷地早熟禾田土壤中筛选出一株低温纤维素酶降解菌LD19，该菌株具有产纤维素酶和半纤维素酶的能力。通过形态学与分子生物学鉴定确定LD19 为钉斑链霉菌（Streptomyces clavifer）。菌株LD19在20 ℃、200 r/min振荡培养102 h时纤维素酶与半纤维素酶活力均达到最高值，纤维素酶活力为21.6 U/mL，半纤维素酶活力为16.8 U/mL。进行酶学性质初步研究，结果表明：该纤维素酶最适反应温度为40 ℃，属低温纤维素酶，最适pH 值为6，在30～70 ℃、pH值4～10时纤维素酶相对酶活力较稳定，Mn2+、Ca2+、Cu2+等对该纤维素酶有激活作用，Zn2+对该酶有抑制作用；该半纤维素酶最适反应温度为50 ℃，最适pH值为6，30～40 ℃处理30 min后剩余相对酶活力在40%左右，pH 值4～9 时相对酶活力稳定，Cu2+、Mn2+、Fe3+对该半纤维素酶有促进作用，Zn2+对该酶的抑制作用最大。