李 洪，陆清平，陈 映，王妹妹，莫海花，王会玉, 郝晓柯

1.琼海市人民医院 检验科，海南 琼海 571400;2.空军军医大学西京医院 检验科，陕西 西安 710032

γ-干扰素释放试验(interferon-γ release assays，IGRAs)选用外周血作为样本，并应用结核分枝杆菌特异抗原早期分泌抗原靶6与培养滤液蛋白10进行检测，不受卡介苗接种、非结核分枝杆菌感染的影响，提高了检测的敏感度和特异性，可以用于结核病的辅助诊断与结核分枝杆菌潜伏感染的检测[1]。目前，国际上较成熟的IGRAs有酶联免疫法检测与酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)检测。肿瘤坏死因子α是一类导致自身免疫性及抗菌性炎症疾病的关键细胞因子[2-3]。糖皮质激素具有抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克等作用，是风湿性疾病、自身免疫病的最基本的治疗药物之一[4-5]。地塞米松是一类常用的长效糖皮质激素。IGRAs基于体外释放试验，通过检测释放γ-干扰素的特异T细胞的数量或特异T细胞释放的γ-干扰素的浓度辅助诊断，而免疫抑制剂的使用可能会影响T细胞活性，从而导致假阴性[6]。本研究旨在探讨肿瘤坏死因子拮抗剂、糖皮质激素、结节对IGRAs检测结果的影响，以期为该类方法在综合性医院各科室结核感染的筛查提供实际的参考价值和应用思路。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取琼海市人民医院2019年1—10月进行IGRA检测的221例患者为研究对象。其中阳性124例，阴性97例。在阳性患者中排除已知的免疫缺陷、接受过免疫抑制药物治疗或糖尿病患者后，随机选取104例(男性55例，女性49例)作为药物影响试验标本。

1.2 研究方法 所有患者采集肝素抗凝血8 ml后，进行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离与提取。将收集的细胞悬液进行活细胞计数，确保每100 μl细胞悬液含25万个细胞。每个标本设置阴性对照N、阳性对照P及两个刺激抗原管TA、TB，分别加入相应抗原及细胞悬液后按说明书步骤进行检测。将104例标本随机分为4组，每组各26例。对照组，PBMCs中均不添加任何药物；地塞米松组，PBMCs中添加2.0 μg/ml地塞米松[7]；英夫利昔单抗组，PBMCs中添加5.0 μg/ml英夫利昔单抗[8]；依那西普组，PBMCs中添加1.5 μg/ml依那西普。根据不同年龄将221例患者分为年龄<15岁组(n=34)、16～30岁组(n=35)、31～45岁组(n=33)、46～60岁组(n=35)、61～75岁组(n=52)、年龄>75岁组(n=32)。根据不同科室将221例患者分为呼吸内科组(n=83)、内分泌风湿免疫科组(n=32)、感染性疾病科组(n=33)、肿瘤-血液-普通内科组(n=28)、儿科组(n=16)、消化内科组(n=29)。分析并比较不同年龄、科室患者的ELISPOT阳性率。

1.3 结果判断 阳性：阴性对照孔斑点数<6，且抗原A/抗原B检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6；阴性对照孔斑点数≥6，且抗原A/抗原B检测孔斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数。阴性：不符合阳性判定结果，且阳性对照孔结果正常。

2 结果

2.1 不同药物对ELISPOT的影响 地塞米松组、英夫利昔单抗组均有1例阳性标本转为阴性，而对照组和依那西普组均为阳性。对照组、地塞米松组、英夫利昔单抗组、依那西普组平均斑点数分别为(61.5±10.4)个、(60.8±10.5)个、(57.5±9.8)个、(61.3±10.8)个，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不同年龄、科室患者ELISPOT阳性率比较 年龄<15岁组、16～30岁组、31～45岁组、46～60岁组、61～75岁组、年龄>75岁组患者ELISPOT阳性率分别为5.9%(2/34)、31.4%(11/35)、33.3%(11/33)、34.3%(12/35)、28.8%(15/52)、28.1%(9/32)。年龄<15岁组患者ELISPOT阳性率显著低于其他各组，差异均有统计学意义(P<0.05)。呼吸内科组、内分泌风湿免疫科组、感染性疾病科组、肿瘤-血液-普通内科组、儿科组以及消化内科组患者的ELISPOT阳性率分别为34.9%(29/83)、25.0%(8/32)、30.3%(10/33)、25.0%(7/28)、6.3%(1/16)、17.2%(5/29)。其中，呼吸内科组的ELISPOT阳性率最高，儿科组的阳性率最低。呼吸内科组的ELISPOT阳性率显著高于儿科组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

随着医学进步与免疫学的不断发展，IGRAs的应用为结核病诊断开辟了新途径，该技术具有操作简单、仪器设备要求低、检测周期短等特点[9]。有研究报道，地塞米松或英夫利昔单抗治疗的患者进行ELISPOT检测均有假阴性风险，但由于进行IGRAs的方法不同，结果受药物影响的程度有所不同[10-11]。本研究结果发现,地塞米松组、英夫利昔单抗组均有1例阳性标本转为阴性；对照组、地塞米松组、英夫利昔单抗组、依那西普组平均斑点数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。这一结果表明，ELISPOT法更不易受糖皮质激素类药物及肿瘤坏死因子拮抗剂的影响，结果更可靠。

本研究结果显示，年龄<15岁组患者ELISPOT阳性率显著低于16～30岁组、31～45岁组、46～60岁组、61～75岁组、年龄>75岁组，差异均有统计学意义(P<0.05)；呼吸内科的ELISPOT阳性率最高，儿科的阳性率最低，且呼吸内科组的ELISPOT阳性率高于儿科组，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，儿童群体的ELISPOT的假阴性发生的概率较大，这可能是由于儿童自身的免疫力低下，ELISPOT检测在出现不确定结果的比例明显升高，与卜范峰等[12]研究结果一致。因此，儿童肺结核患者临床诊断过程中仍应重视病史、临床表现、胸部CT征象及变化，重视痰结核菌涂片及痰结核菌培养等基础检测手段，应反复多次送检，不能因其阳性率低、培养时间长等缺点而否定其重要性。本研究样本量有限，仍需大样本研究加以证实。

综上所述，ELISPOT受糖皮质激素与肿瘤坏死因子拮抗剂的影响不大，其检测结果容易受年龄的影响，对于儿童患者ELISPOT阴性需谨慎对待。