陈伟霞，李佳，牛垚飞，康妍，马纯政，赵爱光

1.河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院），河南 郑州 450000，2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200062；3.河南省人民医院，河南 郑州 450003

国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC）发布了有关全球癌症负担的最新统计数据，至2020 年，全世界估计有1930 万新发癌症病例和近1000 万例癌症患者死亡。其中胃癌新发病例48 万，在世界范围内其发病率位于第5 位、死亡率第4 位[1]。在我国，早期胃癌的检出率仍然偏低，大多数胃癌患者发现时已是进展期，丧失可根治切除的机会，预后较差[2]。对于进展期胃癌患者，传统化疗及放射治疗疗效不佳。由于胃癌高度时空异质性导致精准靶向治疗进展缓慢。

在我国，中医药治疗胃癌的优势主要体现在：延长晚期患者生存期、改善生存质量；术后长期坚持口服中药可减少复发/转移，提高远期效果；减轻根治术后并发症；在化疗期间起到减毒增效作用；预防和治疗癌前病变等方面。众多医家均认为胃癌的发生与正气虚弱、邪毒较盛相关，其中脾胃虚弱被认为是发病的主要病机之一。基于益气解毒理论，以“补益脾胃、解毒散结”为治疗原则，结合科室多年临床治疗胃癌经验组方，形成加味四君子汤。加味四君子汤是在四君子汤的基础上加入藤梨根、壁虎和半夏。该方成分包括太子参、茯苓、白术、壁虎、藤梨根、半夏。太子参、白术、茯苓为基础健脾益气；壁虎、藤梨根清热解毒、消肿散结；姜半夏化痰、降逆止呕。全方配伍达到补益而不滋腻碍胃，祛邪而不损伤脾胃，“祛邪不伤正”、“益气不助邪”的目的。

网络药理学是在计算机虚拟计算和网络数据库检索基础上的研究中药药效物质基础和作用机制的新模式，通过对中药成分、作用靶点以及生物通路进行分析，从而系统分析中药对疾病网络的干预影响，揭示药物治疗作用的分子机制[3]。本研究拟利用网络药理学方法，对加味四君子汤治疗胃癌的主要物质基础和配伍机制进行研究，以期为深入研究该方剂治疗胃癌的科学内涵提供参考。

1 材料与方法

1.1 中药化学成分及作用靶点信息的获取

采用中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php v2.3）[4]检索加味四君子汤中6 味中药的化学成分及靶点。依据药代动力学参数作为化合物分子的筛选条件：药物成分口服生物利用度(Oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性(Drug-likeness，DL）≥ 0.18 的活性成分(ingredients），并利用该技术平台获取活性成分相关的作用靶点(related targets）。

1.2 疾病靶点的获取

检索人类基因-疾病相关的综合数据库Genecard(https：//www.genecards.org/），输入关键词“gastric cancer”，获取与胃癌相关靶标基因，相关性评分限制为≥5。

1.3 中药-活性成分-靶点-疾病相互作用网络的构建及分析

利用R 软件VennDiagram对相关药物活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射，获得加味四君子汤活性成分的潜在抗胃癌作用靶点，并绘制韦恩图(Veen plot）。根据中药活性成分及靶点信息与疾病靶点信息匹配映射的结果，通过Cytoscape 软件构建加味四君子汤活性成分及其潜在抗胃癌作用靶点的相互作用网络。对构建的“加味四君子汤活性成分及其潜在抗胃癌作用靶点的相互作用网络”拓扑结构进行分析，利用连接度值(degree）对加味四君子汤活性成分抗胃癌的作用进行表征，根据连接度值筛选加味四君子汤抗胃癌的主要活性成分和作用靶点。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用String 在线分析平台[5](https：//string-db.org/，v11.0）对33 个关键基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析和GO(Gene Ontology，GO）富集分析，根据P 值＜0.01 选取有意义的生物功能和信号通路。

2 结果

2.1 加味四君子汤活性成分筛选

利用TCMSP 数据库收集加味四君子汤6 味中药含有的化学成分，以口服生物利用度(OB）≥30%且类药性(DL）≥0.18 作为筛选标准，筛选得到太子参、白术、茯苓、半夏、藤梨根和壁虎潜在部分活性成分见表1。数据显示加味四君子汤中太子参125 个化学成分、白术23 个化学成分、茯苓30 个化学成分、半夏172 个化学成分、藤梨根135个化学成分及壁虎163个化学成分。

2.2 加味四君子汤抗胃癌作用靶点筛选

利用该技术平台获取活性成分相关的作用靶点。绘制药物潜在活性成分作用靶点与胃癌相关靶点的韦恩图(Venn plot），获得加味四君子汤活性成分的潜在抗胃癌的作用靶点。其中，太子参(TZS）潜在作用靶点有68 个，白术(BZ）有9 个，茯苓(FL）有8 个，半夏(BX）有51 个，藤梨根(MHLG）有58 个，壁虎(XH）有18 个，加味四君子汤六味中药抗胃癌作用靶点的韦恩图(Veen plot）见图1，六味中药共同作用的靶点有1 个，为PTGS2。

表1 加味四君子汤潜在的活性成分Table 1 Potential active components of Modified Sijunzi Decoction

（续表1）

图1 加味四君子汤抗胃癌作用靶点的韦恩图Figure 1 Venn diagram on the anti-gastric cancer target of Modified Sijunzi Decoction

2.3 加味四君子汤有效化学成分-靶点调控网络及拓扑分析

利用R 软件对加味四君子汤活性成分相关的靶点和胃癌靶点进行映射匹配，获得加味四君子汤潜在活性成分与胃癌疾病靶点之间的对应关系，通过Cytoscape 软件构建加味四君子汤活性成分(Molecule Name）及其潜在抗胃癌作用靶点(Preferred Name）的相互作用网络，结果见图2。

对构建的“加味四君子汤活性成分及其潜在抗胃癌作用靶点的相互作用网络”拓扑结构进行分析，利用连接度值(degree）对该方活性成分抗胃癌的作用进行表征，根据连接度值筛选加味四君子汤抗胃癌的主要活性成分和作用靶点。网络拓扑结构分析结果见表2。连接度最高的5 个活性分子依次为：luteolin(木犀草素）、ursolic acid(熊果酸）、beta-sitosterol(β-谷甾醇）、baicalein(黄芩素）、acacetin(刺槐素），这5个成分可能是加味四君子汤治疗胃癌的主要成分。连接度大于3 的靶基因共33 个，排名前5 的依次为前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin G/H synthase1，PTGS1）、β2肾上腺素能受体(ADRB2）、胃蛋白酶原比值(PGR）和毒蕈碱型胆碱受体M3(CHRM3）。

图2 加味四君子汤活性成分与胃癌作用靶点相互作用的网络图Figure 2 Network Diagram of the interaction between the active components of Modified Sijunzi Decoction and the target of gastric cancer

2.5 关键靶点基因生物功能及通路分析

采用DAVID 6.8 数据库(https：//david.ncifcrf.gov/，v6.8）对PPI 网络中的33 个靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 分析结果如图3 所示，其中生物过程主要涉及类固醇激素反应、细胞程序性死亡、对营养物质的代谢、半胱氨酸型内肽酶在细胞凋亡中的调节作用、雌二醇反应、外源性凋亡信号通路、DNA 模板转录与启动、血液循环、氧化应激、T 细胞活化、发育生长、对机械刺激的反应、细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、丝裂原活化蛋白激酶级联正调节等方面；细胞组成主要参与基膜、核染色质、线粒体外膜、细胞小凹、细胞外间质、细胞质核周区、受体复合体等方面；分子功能主要涉及蛋白质结构域特异性结合、内肽酶活性、类固醇激素受体活性、转录因子结合、G蛋白偶联神经递质受体活性等方面。

KEGG 信号通路分析如图4所示，主要富集的通路为癌症通路、细胞凋亡(Apoptosis）、白介素-17信号通路(IL-17 signaling pathway）、5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse）、甲状腺激素信号通路、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、NF-kappa B信号通路等。

3 讨论

胃癌的发生发展是在正气亏虚的基础上，通过各种因素激化形成癌毒。结合临床分析胃癌贯穿始终的核心病机为脾胃虚弱，癌毒内阻。加味四君子汤方剂组成体现健脾益气结合解毒散结的功效。本研究利用网络药理学方法得出加味四君子汤中有效活性成分抗胃癌的作用靶点有212 个。根据分析加味四君子汤活性成分-抗胃癌作用靶点的相互作用网络图，根据连接度值筛选得出加味四君子汤中抗胃癌的主要活性成分为木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇、黄芩素、刺槐素，这5 个成分可能是加味四君子汤治疗胃癌的主要物质基础。据研究指出木犀草素可通过抑制MAPK 和PI3K 信号通路诱导细胞凋亡[6]；抑制Notch 信号通路逆转上皮间质转化的发生，从而有效抑制胃癌生长[7]。熊果酸可通过诱导BGC-823 胃癌细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1 期，其机制可能与miR-133a表达上调有关[8]。黄芩素在体外内具有抗胃癌细胞侵袭迁移和上皮间质转化作用，其机制与NF-κB/Snail信号通路相关[9]。β-谷甾醇在体内外具有抗胃癌作用，其机制可能与下调P13K/AKT/mTOR 信号通路蛋白表达、诱导SGC-7901 细胞发生自噬有关[10]；刺槐素可以通过激活ROS、上调细胞色素c促使Caspase 的级联反应从而导致胃癌细胞的凋亡[11]。

表2 加味四君子汤潜在活性成分与胃癌疾病靶点相互作用网络拓扑结构分析结果Table 2 Topological structure analysis of the interaction network between the potential active components of Modified Sijunzi Decoction and the disease target of gastric cancer

图3A 加味四君子汤靶标的GO富集分析图（生物过程）Figure 3 A Go enrichment map of the target of Modified Sijunzi Decoction（Biological Processes）

图3B 加味四君子汤靶标的GO富集分析图（细胞组成）Figure 3 B Go enrichment map of the target of Modified Sijunzi Decoction（Cellular Component）

图3C 加味四君子汤靶标的GO富集分析图（分子功能）Figure 3 C Go enrichment map of the target of Modified Sijunzi Decoction（Molecular Function）

图4 加味四君子汤治疗胃癌相关靶蛋白KEGG富集分析通路图Figure 4 The pathway map of KEGG enrichment and analysis in the treatment of gastric cancer with Modified Sijunzi Decoction

靶点PTGS2、PTGS1、ADRB2、PGR和CHRM3在网络中连接度最高，可能为加味四君子汤治疗胃癌的主要潜在靶点。其中，PTGS2为本方剂6味中药的共同靶点。前列腺素内源性过氧化氢合酶(PTGS），又称为环氧化物酶(cyclooxygenase，COX），是人体内前列腺素合成关键的限速酶。PTGS2在各种细胞中可被促炎细胞因子、肿瘤诱导剂、有丝分裂原和生长因子等高度诱导，其主要代谢产物是前列腺素E2，从而参与细胞炎症反应和肿瘤发生发展的病理过程[12]。PTGS2在多种实体瘤中存在高表达，并参与了肿瘤发生发展的众多环节。β2肾上腺素能受体(ADRB2）属于β 肾上腺素能受体中的一种，是重要的G蛋白偶联受体。已有研究显示，其在众多肿瘤细胞中均存在高度表达，β2AR高表达组的皮肤恶性黑色素瘤患者的死亡和复发率显著高于β2AR低表达组，是预测皮肤恶性黑色素瘤患者预后不良的潜在生物标志物[13]；毒蕈碱型胆碱能受体是G 蛋白偶联受体家族成员之一，CHRM3 在消化道肿瘤组织均有高表达[14，15]，有研究显示CHRM3活化能够通过PI3K/Akt 信号通路促进肝癌细胞的侵袭和转移[15]。

KEGG信号通路分析中富集肿瘤相关的通路为白介素-17信号通路、VEGF信号通路、NF-kappa B信号通路等。白细胞介素17(interleukin-17，IL-17）家族细胞因子是一类重要炎症因子，可通过多条信号通路参与肿瘤的发展过程[16]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF）是最强的血管调控生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖、侵袭和迁移等生物活性，在肿瘤血管生成过程中发挥重要的作用。NF-κB 是一种多功能的核转录因子，通过调控肿瘤细胞的基因表达、转录，细胞因子的分泌水平及细胞周期依赖性激酶的表达导致细胞恶性转化。NF-κB 信号通路可调控细胞增殖和凋亡的信号级联放大反应通路，其持续活化与肿瘤的发生密切相关[17，18]，其机制可能由于炎症因子的表达增加相关[19]。

本研究中还存在方法上的局限性，药物活性成分收集不足及网络靶点预测等不可控因素，其结果需要进一步实验基础研究验证。综上所述，本研究通过网络药理学技术阐明加味四君子汤中抗胃癌的主要活性成分为木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇、黄芩素、刺槐素，其主要作用靶点为PTGS2、PTGS1、ADRB2、PGR 和CHRM3，主要通过IL-17、VEGF 和NF-κB 信号通路发挥抗胃癌作用，说明加味四君子汤是通过多成分、多靶点、多通路协同发挥抗胃癌药理作用的。本研究从系统生物学的角度揭示了加味四君子汤治疗胃癌的作用机制与物质基础的科学内涵。