许瑶，许尤琪

江苏省第二中医院，江苏 南京 210017

胃癌是全球常见的恶性肿瘤，我国尤其高发。大部分患者在确诊时已是中晚期，对于无法手术治疗的转移性或晚期胃癌及术后复发的病例，采用细胞毒药物进行化疗的患者，其中位生存期(overall survival，OS）仅约11 个月左右。分子靶向治疗的临床运用为晚期胃癌提供了新的治疗方法。有研究确立了抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名：赫赛汀）在治疗晚期胃癌中的作用，使其成为HER-2阳性患者的标准治疗[1]。

刘河等[2]从基因微观分子水平对胃癌中医不同辨证分型进行研究，发现胃癌6 种中医证型中HER-2 阳性表达率由高到低依次为痰湿凝结型、瘀毒内阻型、气血双亏型、肝胃不和型、脾胃虚寒型、胃热伤阴型。“脾虚”、“痰湿”反映着胃癌患者尤其是HER-2 阳性者处在不同的病变发展阶段机体内邪正盛衰的偏胜情况。胃癌晚期患者，脾虚证广泛存在。脾主运化，若脾气虚弱，运化功能失常，不能布散水谷精微，津液代谢障碍，水液停滞，则聚而成痰，故有“脾为生痰之源”之说。胃癌各中医证型病灶组织中HER-2 蛋白表达阳性率均高于慢性萎缩性胃炎患者，且胃癌中医辨证为实证患者均具有较高的HER-2 阳性表达率[3]。因此从痰论治正是HER-2阳性胃癌的治疗大法之一。

笔者课题组根据长期的临床经验，并依据胃癌病机特点拟定了健脾化痰复方，由黄芪、仙鹤草、薏苡仁、玄参、白花蛇舌草、苦参等中药组成。方中黄芪、仙鹤草健脾益气为君药，薏苡仁、猪苓利湿化痰，为臣药；玄参、女贞子、鸡血藤养血活血，白花蛇舌草、苦参抗癌解毒，共为佐药；再辅以威灵仙通行十二经络，软坚散结，为使药。诸药并用，共奏健脾化痰、抗癌解毒之功。前期实验研究方面，发现健脾化痰方能抑制SGC-7901 荷瘤裸鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）、Ki-67的表达、人胃癌MGC-803 细胞Bcl-2、COX-2 的表达，下调前胃癌MFC 瘤组织P53、Survivin 的表达，上调Bax表达[4-8]。基于上述健脾化痰方对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究，本研究进一步观察健脾化痰方对HER-2 阳性胃癌肿瘤细胞生长及凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物本实验采用的研究动物为BALB/c雄性裸鼠80 只，5～7 周龄，每只体重约为18～20 克。裸鼠购自南京沐途医疗科技有限公司，动物合格证号为SYXK(苏）2016-0010，SPF 级动物实验室条件下饲养，动物实验室许可证号为SYXK(苏）2016-0018。HER-2阳性人NCI-N87胃癌细胞株由南京凯基生物科技发展有限公司提供。

1.2 药物及试剂健脾化痰复方制剂，处方组成：黄芪30 g，仙鹤草30 g，薏苡仁30 g，猪苓15 g，玄参15 g，女贞子20 g，鸡血藤30 g，白花蛇舌草30 g，苦参15 g，威灵仙30g 等，由南京中医药大学第二附属医院药材制剂中心制备成含生药约5.31 g/ml 的中药煎剂。注射用曲妥珠单抗(赫赛汀），440 mg(20 ml）/瓶，上海罗氏公司，生产批号：N7392，贮存条件：2～8 ℃。TUNEL 凋亡检测试剂盒购自上海罗氏公司。

2 方法及分组

2.1 细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养NCI-N87细胞，每1～2 d更换1次培养液；约3～4 d 贴壁率＞90%，2～3 d 传代1 次，连续培养，培养至一定数目时，将对数生长期NCI-N87细胞用于实验。

2.2 人胃癌移植瘤模型的建立及分组取对数生长期的人NCI-N87 胃癌细胞，制成单细胞悬液，每只动物取0.2 ml 接种于右侧腋部皮下，1 周后观察成瘤情况，当皮下移植瘤长至直径约4 mm 时，则认为移植瘤模型成功。将实验动物随机分为空白组、健脾化痰方低剂量组(低剂量组）、健脾化痰方中剂量组(中剂量组）、健脾化痰方高剂量组(高剂量组）、赫赛汀组及健脾化痰方低、中、高剂量联合赫赛汀组，各组10 只。于分组当天开始给药，健脾化痰方低剂量组20 g/kg，中剂量组40 g/kg，高剂量组80 g/kg，灌胃给药，持续3 周；赫赛汀组腹腔注射首剂按40 mg/kg 给药，1 周1次，随后按20 mg/kg 给药[9]；赫赛汀联合健脾化痰方组，则按健脾化痰方低、中、高剂量联合赫赛汀剂量给药，持续3周；空白组予中药同等体积的生理盐水灌胃3周。

2.3 观察指标接种后1周起，每隔3天用电子游标卡尺测量移植瘤最大直径(a）及横径(b），4周后用颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离瘤组织，测离体瘤径；计算抑瘤率、绘制肿瘤生长曲线。

Steel 公式[10]：(1）肿瘤体积V=a × b2/2；(2）抑瘤率(%）=[(对照组平均瘤V1-治疗组平均瘤V2）/对照组平均瘤V1]×100%

2.4 采用TUNEL 法检测细胞凋亡用4%多聚甲醛处理移植瘤组织，在显微镜下观察并采集染色后图像。计算阳性率来反应凋亡程度，高倍镜下连续计数5 个随机视野各100 个细胞，5 个视野中阳性细胞总数所占百分比作为凋亡指数(Apoptosis index，AI），AI=凋亡阳性细胞总数/总的细胞数×100%。

2.5 统计学方法应用SPSS 19.0软件进行数据分析，定量资料以均数±标准差(）描述，定性资料以百分数描述。多组间比较，若符合正态分布且方差齐则使用单因素方差分析；两组间比较采用t检验；定性资料的比较使用卡方检验。给出检验统计量及其对应P值，以P＜0.05作为差异有统计学意义，P＞0.05无统计学意义。

3 结果

3.1 健脾化痰方对移植瘤生长的影响

记录每天给药后胃癌肿瘤体积的变化，描绘肿瘤生长曲线，结果如图1所示，各组胃癌肿瘤体积变化呈不同的变化趋势。对照组裸鼠移植瘤体积一直呈增长趋势；实验进行第27 天，各治疗组与对照组比较，裸鼠移植瘤体积均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05），且中药联合组对肿瘤生长抑制作用更明显，给药开始时肿瘤体积生长缓慢，至实验进行第15 天肿瘤体积呈明显缩小趋势。

图1 人胃癌裸鼠移植瘤生长曲线Figure 1 Growth curve of human gastric cancer xenograft tumor in nude mice

3.2 健脾化痰方对移植瘤瘤重的影响

各治疗组瘤重与对照组比较均减轻且差异有统计学意义(P＜0.05）；联合组瘤重减轻更多(P＜0.05）；健脾化痰方联合组与赫赛汀组比较，瘤重更轻且差异有统计学意义(P＜0.05）。见表1。

表1 移植瘤平均瘤重及抑瘤率(）Table 1 Average tumor weight and tumor inhibition rate of transplanted tumor

表1 移植瘤平均瘤重及抑瘤率(）Table 1 Average tumor weight and tumor inhibition rate of transplanted tumor

注：在抑瘤率方面比较：①表示健脾化痰方组与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05）；②表示联合组与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05）；③表示联合组与赫赛汀组比较差异有统计学意义(P ＜0.05）。

3.3 健脾化痰方对移植瘤细胞凋亡的影响

通过采用TUNEL 法检测发现治疗组均存在细胞凋亡现象，治疗组AI 均高于对照组，并随着健脾化痰方剂量的增加，凋亡效应逐渐增强，且呈现一定的浓度依赖性。移植瘤细胞凋亡程度情况具体见表2。

表2 TUNEL法检测移植瘤凋亡阳性细胞表达率(%，）Table 2 Expression rate of apoptotic positive cells in transplanted tumor detected by TUNEL method

表2 TUNEL法检测移植瘤凋亡阳性细胞表达率(%，）Table 2 Expression rate of apoptotic positive cells in transplanted tumor detected by TUNEL method

注：在细胞凋亡方面比较：①表示健脾化痰方组与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05）；②表示联合组与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05）；③表示联合组与赫赛汀组比较差异有统计学意义(P ＜0.05）。

4 讨论

本研究通过建立人胃癌NCI-N87 细胞裸鼠移植瘤模型，在裸鼠体内观察不同剂量健脾化痰方对胃癌肿瘤组织生长的影响，观察到健脾化痰方可抑制胃癌组织的生长；通过TUNEL 法检测凋亡指数，发现健脾化痰方可诱导胃癌细胞的凋亡。

本研究发现各治疗组对胃癌肿瘤的生长均有抑制作用，特别是中药联合组显示出更强的抑制作用，这可能与在赫赛汀治疗过程中加入健脾化痰方有关，由于肿瘤作用机制的复杂性，药物的作用机理也随之发生改变。赫赛汀的主要作用机制可能是：①特异结合于HER-2 受体胞外段从而阻断HER-2 同源二聚体的组成性激活，并干扰HER-2与其他ErbB 家族成员形成异源二聚体；②介导HER-2 受体的内吞和在溶酶体中的降解以及抑制HER-2 受体胞外段的裂解[11]；③通过活化PTEN(phosphatase and tensin homolog）阻断HER-2介导的PI3K/AKT 信号通路，该通路是细胞将胞外生长因子信号传递至胞内的关键通路，负责调节细胞的代谢、增殖和凋亡；④通过调整血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）水平从而起到抑制肿瘤血管生成的作用；⑤通过诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用进而杀伤肿瘤细胞[12]。健脾化痰方的抑瘤作用可能是通过诱导胃癌裸鼠移植瘤细胞凋亡。赫赛汀联合组比健脾化痰方组抑瘤作用强，联合使用起到协同抑制作用，具体的作用机制是否与PI3K/AKT 信号通路需进一步研究。

综上所述，健脾化痰方对HER-2 阳性NCIN87胃癌裸鼠移植瘤具有抑制作用，可以诱导胃癌细胞的凋亡，联合赫赛汀使用能增强其诱导凋亡作用。本研究为中药治疗HER-2 阳性胃癌提供实验研究依据。