蒋 杉，杜 凤，康秉文，殷草草，周 健，石 莹，王 玥，周耿瑶，秦绪军，*

（1.空军军医大学军事预防医学系，军队健康教育与管理教研室，陕西 西安 710032；2.陕西中医药大学公共卫生学院，陕西 咸阳 712046)

在全球范围内，老年人(65 岁或以上)的比例正在上升，老年人口成为了增长最快的年龄组。根据联合国2019 年报告的数据，2019 年全球人口中每11 人中就有1人超过了65岁，到2050年，这一比例将增加到每6人中有1人是65岁以上的老年人。老龄化人口的数量逐渐增多，势必给社会带来巨大的负担。如果能延缓老年人的衰老程度，减少老年人疾病的发生，提高老年人的生活质量，就能在一定程度上缓解人口老龄化带来的社会负担。因此，迫切需要深入了解衰老进程及机制，并寻找有效的抗衰老干预措施。

异鼠李素(isorhamnetin，ISO)是黄酮类化合物中一种含量较丰富的O-甲基化黄酮醇，普遍存在于沙棘、银杏等植物中。由于其具有多种生物和药理性质，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、抗缺血再灌注损伤，以及内皮功能障碍和神经退行性损伤的保护作用等，ISO的应用前景已获得广泛的关注。然而，ISO是否具有抗衰老作用，目前尚未见明确报道。本研究通过D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)建立衰老细胞模型，探讨ISO的抗衰老作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

紫外线超净台(江苏苏净安泰)；CKX41 倒置显微镜(日本Olympus)；二氧化碳孵育箱(美国Thermo)；5424R 高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；台式低速离心机(陕西环宇)；Infinite200 PRO 全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan)；蛋白电泳仪、Trans Blot Turbo蛋白转印系统、凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。

1.2 主要试剂

异鼠李素(美国Target Mol，纯度≥98%，批号T2836)；DMEM 高糖液体培养基(美国Gibco)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素-链霉素溶液(上海源培)；BCA 蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo)；细胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence associated βgalactosidase，SA-β-Gal)染色试剂盒(上海碧云天)；CCK-8 试剂盒(上海汉恒)；2′7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2, 7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFHDA) 荧光探针、 总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT) 活 性 试 剂 盒 ( 上 海 碧 云 天)； 丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(江苏凯基)；GAPDH 兔抗单克隆抗体、p27鼠抗单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology)；p21、核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)兔抗单克隆抗体(武汉三鹰)；CAT、 SOD1、 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 酶 1(glutathione peroxidase 1，GPX1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate cysteine ligase modifier subunits，GCLM)兔抗单克隆抗体、SOD2 鼠抗单克隆抗体(美国Santa Cruz)；谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunits，GCLC)兔抗单克隆抗体(南京巴傲德)；血红素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)兔抗单克隆抗体(英国Abcam)。

1.3 方 法

1.3.1 细胞培养与处理

将HUVEC 在添加了10%FBS，1%谷氨酰胺和1%青/链霉素溶液的DMEM培养基中于CO体积分数为5%和37 ℃培养箱中进行培养。取第20～23代的HUVEC置于含有不同浓度ISO(0～80 μmol/L)的DMEM中孵育72 h，观察ISO对细胞活力的影响。然后，将HUVEC分别与5、10 μmol/L ISO在10 g/L D-Gal存在下孵育72 h，分为：对照组，正常培养的HUVEC；D-Gal 处理组，10 g/L D-Gal 处理72 h；2 个 ISO 干预组(D-Gal+ISO)，即 10 g/L D-Gal处理，同时分别用5或10 μmol/L ISO共培养细胞。

1.3.2 CCK-8法测定细胞活力

细胞按每孔5×10个接种在96 孔板上，加入不同浓度的ISO(0、5、10、20、40、80 μmol/L)，在CO体积分数为5%和37 ℃条件下孵育72 h。更换培养基，每孔加入100 μL 新鲜DMEM和10 μL CCK-8试剂，并在CO体积分数为5%，37 ℃条件下继续孵育2 h。酶标仪测定

D

(450)值并计算细胞活力。

1.3.3 SA-β-Gal 染色

使用 SA-β-Gal 染色试剂盒进行HUVEC的SA-β-Gal染色。首先将细胞固定，然后在37 ℃(无CO)下用SA-β-Gal 染色溶液染色24 h。光学显微镜观察细胞并成像。

1.3.4 MDA含量、SOD和CAT活性测定

用裂解液充分裂解各组处理后的细胞，12 000 g 离心20 min，收集上清并测量上清中的MDA含量。另将上清液稀释3～4 倍，用于检测SOD 和CAT 活性。具体步骤严格按照MDA、SOD和CAT试剂盒的说明书进行。

1.3.5 细胞总活性氧水平的测量

使用测定试剂盒测量细胞总活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。将处理的各组细胞与DCFH-DA在37 ℃避光孵育30 min，用PBS 洗涤3 次，去除细胞外的荧光染料。用酶标仪测量平均荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.3.6 Western blot 检测分析

将HUVEC 在含有50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)，150 mmol/L NaCl，1%脱氧胆酸钠，1% NP-40、1 mmol/L 苯基甲基磺酰氟和1 mmol/L 乙二胺四乙酸的RIPA 裂解液中裂解。使用BCA蛋白定量试剂盒测量上清液中总蛋白质含量。细胞裂解物上清液通过SDS-PAGE 分离，并电转移到PVDF 膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭2 h，并与相应一抗在4 ℃孵育过夜。第2 天用TBST 将PVDF 膜洗涤3 次，每次5 min，然后与二抗一起在室温下孵育2 h。用 TBST 洗涤 4 次后，将发光液 A 和 B 按 1∶1 混合后均匀滴于PVDF 膜上，并用凝胶成像系统拍照。使用Bio-Rad Quantity One软件对条带强度进行定量。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 ISO对HUVEC活力的影响

图 1 结果表明，当 ISO 在浓度≥20 μmol/L 时，细胞活力显著降低。因此，后续使用5 和10 μmol/L 的ISO进行实验。

图1 不同浓度的ISO处理后对HUVEC活力的影响

2.2 ISO对D-Gal诱导的HUVEC衰老的影响

图2 ISO对D-Gal诱导的HUVEC衰老的影响

ISO 对D-Gal 诱导的HUVEC 衰老的影响见图2。与对照组比较，D-Gal处理72 h引起HUVEC中β-Gal染色显著增加。不同浓度的ISO(5和10 μmol/L)均能显著降低由D-Gal 引起的β-Gal 阳性染色。与对照组比较，D-Gal 处理后p21、p27蛋白表达水平较对照组显著升高(

P

＜0.05)；与D-Gal 处理组比较，ISO 显著抑制p21 和p27 的蛋白表达水平(

P

＜0.05)。细胞周期抑制蛋白p21、p27表达增加被认为是衰老的分子标志。这些结果表明，ISO可以减轻D-Gal诱导的HUVEC衰老。

2.3 ISO 对 D-Gal 诱导的 HUVEC 总 ROS 与 MDA 水平的影响

ISO 对 D-Gal 诱导的 HUVEC 总 ROS 与 MDA 水平的影响如图3 所示。与对照组相比，D-Gal 组HUVEC中总 ROS 和 MDA 水平均升高(

P

＜0.05)；与 D-Gal 组比较，ISO处理后ROS和MDA水平均降低，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)。这些结果表明，ISO 能够抑制DGal 诱导的细胞总ROS 和MDA 水平，从而减轻D-Gal诱导的衰老。

图3 ISO对D-Gal诱导的HUVEC的总ROS与MDA水平的影响

2.4 ISO 对D-Gal 诱导的HUVEC 抗氧化酶活性的影响

图4 ISO素对D-Gal诱导的HUVEC抗氧化酶活性的影响

ISO 对D-Gal 诱导的HUVEC 抗氧化酶活性的影响如图4所示。与对照组相比，D-Gal 处理的HUVEC 中SOD和CAT活性显著降低(

P

＜0.05)；与D-Gal处理组比较，当与ISO 共培养时，这些抗氧化酶的活性均有不同程度的恢复(

P

＜0.05)。结果表明，ISO 可以提高HUVEC 中的抗氧化酶活性，从而缓解氧化应激。同时，本研究发现，D-Gal 组和对照组SOD 活性绝对值差别不大，这可能是由于HUVEC 的抗氧化系统在DGal组中并未完全崩溃，D-Gal导致细胞产生的ROS仍然多于抗氧化防御系统清除的ROS。而ISO 处理组既减少了ROS 的产生，又提高了抗氧化系统的防御能力，因此，有较大的升高。

2.5 ISO对D-Gal诱导的HUVEC中Nrf2及其下游蛋白的影响

ISO 对 D-Gal 诱导的 HUVEC 中 Nrf2 及其下游蛋白的影响如图5 所示。与对照组相比，经D-Gal 处理的HUVEC 细胞中核内 Nrf2 水平降低(

P

＜0.05)，GCLM、GCLC、HO-1、SOD1、SOD2、CAT、GPX1 等下游蛋白表达水平均降低(

P

＜0.05)，表明Nrf2通路在D-Gal处理后受到抑制。与D-Gal 处理组比较，ISO 能够显著提高核内Nrf2 及其下游蛋白的表达水平(

P

＜0.05)。这些结果表明，ISO 能够激活Nrf2 通路并提高细胞抗氧化能力，可能是ISO 发挥上述抗氧化、抗衰老的重要机制之一。

3 讨 论

衰老是生命进程中的一种生理状态，并受多种内外环境影响。细胞周期停滞是衰老的重要特征。已有研究表明，D-Gal 可以引起类似于衰老的生理状态改变。D-Gal 诱导衰老模型应用广泛，具有操作方便，副作用少，细胞生存率较高等优势，被认为是衰老研究的有效工具。本研究中采用10 g/L的D-Gal处理HUVEC 72 h 可以有效诱导细胞SA-β-Gal 活性增加和细胞周期相关衰老标志蛋白p21 和p27 水平增加，表明细胞衰老模型的成功建立。已有研究报道ISO 对多种疾病均有治疗作用，而ISO 对衰老的作用却鲜见报道。朱栋良等在研究中发现，ISO通过促进肿瘤细胞衰老来抑制肿瘤的增殖和生长。然而，ISO 对正常细胞衰老的影响还未见报道。本研究中，我们发现ISO能够显著抑制D-Gal诱导的SA-β-Gal活性及衰老相关蛋白p21、p27水平的增加，表明ISO具有抗细胞衰老作用。

图5 ISO对D-Gal诱导的HUVEC的Nrf2及其下游蛋白的影响

细胞衰老可受多种因素影响，其中一个重要因素就是氧化应激(oxidative stress，OS)。OS是指ROS的产生与细胞抗氧化防御系统清除ROS之间的不平衡。OS能够引起细胞大分子包括脂质、膜、蛋白质和DNA的损伤，进而促进细胞衰老。本研究发现，在D-Gal诱导HUVEC 衰老过程中，ROS 和氧化损伤产物MDA水平均升高，而总SOD和CAT活性均下降，抗氧化防御系统清除ROS的能力降低。而ISO能够显著改善DGal造成的OS，表现为ROS和MDA水平降低，总SOD和CAT 活性升高。以上结果表明ISO 可能是通过减轻OS来抗衰老。

Nrf2 通路由Kelch like-ECH 相关蛋白1(Kelchlike ECH-associated protein-1，Keap1)、下游 II 期解毒酶和抗氧化酶组成。在正常情况下，Nrf2 与Keap1结合并停留在细胞质中。在OS作用下，Nrf2与Keap1解离并移至核内与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，从而直接调控其下游的抗氧化酶和解毒酶的转录。GCLC 和GCLM 是谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)的重要组成部分，它们可以调节谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成速率。GSH 是GPX 将氢过氧化物还原为相应醇的重要还原剂，可以提高GPX 活性，缓解OS。血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)可以通过产生一氧化碳来提高SOD活性，使氧自由基转化为过氧化氢。另外，有文献报道，HO-1还可以减弱内毒素对CAT活性的影响，促使过氧化氢分解成氧和水，从而发挥抗氧化作用。Nrf2 通路的激活增强了细胞清除ROS 和应对OS 的能力，是保护细胞免受OS 侵袭的重要抗氧化防御机制。本研究发现，DGal 处理能够抑制核内Nrf2 及其下游蛋白HO-1、GCLC、GCLM、SOD1、SOD2、CAT、GPX1 的表达水平，而ISO 可以提高核内Nrf2 及其下游蛋白的表达水平。这些结果进一步表明ISO 可能是通过激活Nrf2 通路，减轻了OS，从而延缓了衰老。

综上所述，本研究采用D-Gal诱导HUVEC建立细胞衰老模型，发现ISO 可以显著提高细胞抗氧化的能力，缓解D-Gal 引起的OS，延缓细胞衰老，而激活Nrf2通路可能是其中重要的机制。该结果为深入研究ISO 抗衰老作用以及进一步开发利用提供了实验室依据。