李柏茹 ，秦双建，李闰冰，蔡 颖 ，郑 凯 ，曾 明，肖 芳，*，徐新云

(1.中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙410078；2.深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518055；3.南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

大气细颗粒物(fine particulate matter，PM)是指大气中空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，可以经呼吸道直接进入支气管和肺泡深处，甚至可以伴随血液进入循环，到达全身各个脏器。2013 年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将室外空气污染的主要成分-大气细颗粒物归类为致癌物。PM可以诱导产生氧化应激、炎症反应、免疫紊乱、DNA损伤和遗传毒性、信号通路改变等。在一项中国横断面研究中发现长期暴露于浓度范围较广的PM与慢性肾脏病患病率增加之间存在显著相关性，同时国外流行病学调查发现室外空气污染与肾癌的发生密切相关，但既往研究皆是关于PM对肺脏健康影响的研究，并发现PM可致人正常肺上皮细胞中p38 蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK)在蛋白水平表达升高。

p38MAPK 是MAPKs 家族中的主要成员之一，应激原(如缺氧、热休克、紫外线等)和炎性因子都可刺激其激活，通过磷酸化MAPK中的苏氨酸和酪氨酸残基而活化MAPK，导致细胞增生、分化、凋亡、坏死等。肾小管细胞的凋亡与p38MAPK 蛋白有着密切的联系，p38MAPK 与急性肾损伤、糖尿病肾脏病、狼疮性肾炎、多囊肾、终末期肾脏病等疾病的发生发展存在关联。因此本文利用基因沉默技术构建

p38MAPK

基因沉默 HK-2 细胞，探讨

p38MAPK

基因对PM染毒HK-2细胞后部分癌基因和凋亡相关基因表达的影响，为深入研究

p38MAPK

基因在PM致HK-2肾细胞损伤的毒理学机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

限制性内切酶

Eco

R Ⅰ、

Bam

H Ⅰ和

Kpn

Ⅰ购于美国Thermo Scientific 公司；T4 DNA ligase 购于NEB公司；质粒小提取试剂盒购于美国OMEGA Bio-Tek公司；RNeasy Mini Kit 购于德国QIAGEN 公司；PrimeScriptRT Reagent Kit、 SYBR Primescript RTPCR Kit 和真核表达载体 PLVX-shRNA2-puro 购于日本TaKaRa 公司；

J107

大肠杆菌感受态购于Biocan生物公司；包装辅助质粒PLVX-GFP和慢病毒包装试剂盒购于日本Clontech 公司；HK-2 细胞购于中国上海细胞库，0.25% Trpsin-EDTA、DMEM 培养基和胎牛血清购于美国Gibco 公司；RNeasy Mini Kit购于德国Qiagen公司，目的基因PCR引物由上海生工合成；p38MAPK 兔抗人单克隆抗体(#8690S)和c-myc兔抗人单克隆抗体(#9402)购于美国Cell Signaling 公司；Caspase-8 鼠抗人单克隆抗体(sc-81656)、Bcl-2鼠抗人单克隆抗体(sc-7382)和GAPDH 鼠抗人单克隆抗体(sc-365062)均购于美国Santa Cruz公司；二抗(羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP)购于美国Thermo Scientific公司。

1.2 PM2.5样品采集与制备

用武汉天虹TH150F中流量采样器和80 mm 直径的石英滤膜，按100 L/min 的流量连续采样，每天采样24 h，连续采3 d，采样地点位于太原山西大学校园。本实验对采集到吸附有PM的滤膜称取质量，后剪为2 cm×2 cm小片放于烧杯中，加入超纯水完全浸没滤膜，使用锡箔纸封口，超声振荡30 min 后取出滤膜，将PM样品悬浊液转移至干净的真空冷冻物料盘中，再次用锡箔纸将物料盘密封后置于-80 ℃冰箱冷冻24 h；用封口膜替换锡箔纸密封物料盘并在封口膜上点出密集小孔，于真空冷冻干燥机中干燥24 h，至PM完全干燥；无菌工作台中紫外灯灭菌2 h后用超纯水溶解干燥的PM颗粒，混合均匀后完成PM混悬液的制备，分装标记后于-20 ℃保存待用，每次使用前振荡混匀。

1.3 设计合成shRNA

在NCBI 查找

p38MAPK

的全序列，设计干扰序列，将干扰序列打乱并进行随机突变得到阴性对照序列，委托生工合成

p38MAPK

-shRNA和阴性对照序列shRNAc，见表1。

表1 shRNA干扰引物序列

1.4 p38MAPK基因沉默病毒载体的构建与包装

利用

Eco

RⅠ和

Bam

HⅠ对载体pLVX-shRNA1 进行双酶切，37 ℃酶切30 min 后，再次添加限制性内切酶37 ℃酶切30 min。将酶切后的载体进行琼脂糖凝胶电泳回收，按照体系添加试剂，混合均匀后放置于已煮沸的水中，待自然冷却至室温即退火完成后再加入1 mL ddHO。按照体系添加试剂使退火后得

p38MAPK

基因与酶切后pLVX-shRNA1 相连接，16 ℃连接过夜。将连接产物与感受态细胞混匀后冰浴 30 min，42 ℃热激70 s，随后立即置冰上放置2 min，加入预热至室温的150 μL TB 培养基，250 r/min，37 ℃恒温摇床培养1 h，用移液器取100 μL均匀涂在含100 μg/mL 青霉素抗性的TB 平板上，倒置并于37 ℃恒温培养箱培养过夜。参考质粒小提试剂盒(Omega，D6950-02)说明书对阳性克隆子的质粒进行提取。将提取的质粒分别用

Eco

RⅠ和

Kpn

Ⅰ，

Bam

HⅠ和

Kpn

Ⅰ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将提取的质粒送往测序中心进行测序。将酶切鉴定片段正确的质粒送往上海生工进行测序鉴定。挑取测序正确的重组载体，通过Lipofecatmin 2000分别瞬时转染到HK-2细胞中，培养24 h后，进行荧光定量PCR，检测

p38MAPK

基因的表达水平变化，选取干扰效率最高的载体(pLVX-C-MYC-shRNA2)进行慢病毒的包装。按照Lenti-XLentiviral Expression Systems 试剂盒说明书步骤将pLVX-

p38MAPK

-shRNA2 包装慢病毒，在37 ℃，CO体积分数为5%条件下大量培养细胞，消化细胞进行铺板，待细胞的融合率在90%时将转染试剂、包装质粒、目的质粒混合均匀滴入培养皿中进行转染，收集上清培养基，超速离心并过滤以纯化浓缩慢病毒，检测过滤好的病毒滴度。

1.5 慢病毒转染HK-2细胞

对HK-2 细胞进行有效Puromycin 筛选浓度检测，按照每孔1×10个细胞的浓度将HK-2细胞接种到6孔板，在37 ℃，CO体积分数为5%的培养箱中培养，每孔分别加入 0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 μg/mL 嘌呤霉素对正常HK-2细胞进行筛选预实验，随后使用筛选的浓度对转导慢病毒后的HK-2细胞进行筛选。将HK-2细胞接种于6孔板中，培养18 h后待细胞汇合度达到50%时，加入10 μL 的病毒上清，继续培养24 h后去除含慢病毒的培养基，加入新鲜的DMEM完全培养基再培养24 h，随后在荧光倒置显微镜下观察HK-2 细胞感染带有绿色荧光蛋白标签的病毒感染效果，换用1 μg/mL 嘌呤霉素对细胞进行筛选，每隔2 d 换液一次，筛选时间为7 d，筛选完成后，去除培养瓶中含嘌呤霉素的完全培养基，加入正常的完全培养基使细胞正常生长。

1.6 p38MAPK基因沉默细胞株鉴定

1.6.1 实时荧光定量PCR 检测 基因表达水平

将HK-2细胞和

p38MAPK

基因沉默细胞接种至6 孔板，待细胞底面覆盖率达到80%～90%时，用RNeasy Mini Kit 提取细胞总RNA，用Prime Script RT Reagent Kit 将总RNA 反转录为cDNA。取2 种细胞的cDNA 各1 μL 为模板进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，检测

p38MAPK

基因表达水平的变化，PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列见表2。

表2 p38MAPK基因和内参基因PCR引物

1.6.2 Western blot 检测p38MAPK 蛋白表达水平

取HK-2 细胞和

p38MAPK

基因沉默细胞各1 瓶(25 cm细胞培养瓶)，弃培养基并用PBS 洗3 次，加入200 μL IP细胞裂解液裂解30 min，将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白后于4 ℃离心30 min，12 000 r/min，加入5×SDS-PAGE 上样缓冲液，100 ℃变性8 min。配制10%分离胶，5%浓缩胶，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，湿转法90 min 将蛋白完全转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h；分别使用p38MAPK抗体和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3 次，每次10 min，再加入二抗于室温孵育1 h，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入 Western blot化学发光试剂后在冷CCD成像系统中进行显影，所得图像利用ImageJ软件进行条带灰度定量分析。

1.7 PM2.5染毒正常 HK-2 细胞和p38MAPK 基因沉默HK-2细胞

使用DMEM 完全培养基(含10%胎牛血清)于37 ℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养HK-2细胞和基因沉默细胞，根据前期CCK-8 试验得到PM染毒的IC为95.98 μg/mL，本实验设定PM的染毒剂量为50 μg/mL，以不含血清和PM的DMEM 培养基作为阴性对照。细胞分为4 组：未染毒正常肾细胞、未染毒

p38MAPK

基因沉默细胞、PM染毒正常肾细胞和PM染毒

p38MAPK

基因沉默细胞，待细胞状态稳定且汇合度达80%时进行染毒，在37 ℃、CO体积分数为5%条件下染毒培养24 h后检测癌基因与凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达水平。

1.8 目的基因mRNA和蛋白水平表达情况检测

1.8.1 荧光定量PCR 检测目的基因mRNA 表达水平

染毒24 h后，按照1.6.1的方法提取RNA，将RNA 反转录为cDNA，按照说明书配置qPCR反应体系，检测癌基因(

c-myc

、

c-fos

、

p53

)和凋亡相关基因(

Caspase-8

、

Caspase-9

、

Bcl-2

)的相对表达量，目的基因的引物均委托上海生工公司合成，引物序列见表3。

表3 癌基因和凋亡相关基因PCR引物

1.8.2 Western blot 检测目的蛋白表达水平

染毒24 h 后的细胞按照方法1.6.2 提取总蛋白并进行定量，SDS-PAGE 凝胶电泳后，按200 mA的电流湿转90 min，再用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。根据目的蛋白相对分子质量大小，切取膜上相应条带，按说明书上的比例加入相应的一抗后冰上孵育过夜；1×TBST洗膜3 次，每次10 min。按1∶3 000 的比例稀释HPR标记的羊抗鼠二抗、HPR标记的羊抗兔二抗，室温下孵育1 h；1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入化学发光试剂后用冷CCD 成像系统对其进行曝光拍照，所得图像用ImageJ软件进行条带灰度定量分析。

1.9 统计分析

2 结 果

2.1 p38MAPK基因沉默细胞的鉴定

qPCR 检测结果见图1，与正常HK-2 细胞相比，

p38MAPK

基因沉默 HK-2 细胞中 p38MAPK mRNA 表达下降58.50%，差异有统计学意义(

P

＜0.01)。Western blot 检测结果见图2，与正常HK-2 细胞比较，

p38MAPK

基因沉默 HK-2 细胞中

p38MAPK

蛋白表达下降了51.33%，差异有统计学意义(

P

＜0.01)。

图1 荧光定量PCR检测结果

图2 Western blot检测结果

2.2 PM2.5染毒后HK-2 细胞凋亡相关基因和癌基因mRNA表达水平变化

图3 PM2.5染毒两种细胞24 h后部分凋亡相关基因和癌基因mRNA表达水平变化

qPCR 实验结果见图3，用浓度为50 mg/mL 的PM混悬液对HK-2 细胞和

p38MAPK

基因沉默HK-2细胞染毒24 h 后，与对照组HK-2 细胞比较，PM染 毒 HK-2 细 胞 组 中 c-myc、 c-fos、 Caspase-8 和Casepase-9 mRNA 表达分别升高39.89%、15.12%、19.47%和15.45%，p53 和Bcl-2 mRNA 表达分别下降21.54%和31.77%，差异均具有统计学意义(

P

＜0.05)。与PM染毒HK-2细胞组比较，PM染毒

p38MAPK

基因沉默HK-2细胞中c-myc、c-fos、p53、Caspase-8和Caspase-9 mRNA 表达分别下降了84.55%、63.55%、34.49%、37.19%和54.97%，差异均具有统计学意义(

P

＜0.05)；Bcl-2 mRNA的表达水平无明显变化。

2.3 PM2.5染毒后凋亡相关基因和癌基因的蛋白表达水平变化

Western blot 实验结果见图4 和图5，用浓度为50 mg/mL 的PM染毒24 h后，与对照组HK-2细胞相比，PM染毒HK-2细胞组中c-myc和Caspase-8蛋白表达分别升高19.55%和12.74%，Bcl-2蛋白表达下降17.82%，差异均具有统计学意义(

P

＜0.05)；与PM染毒组HK-2细胞相比，PM染毒

p38MAPK

基因沉默组HK-2细胞中c-myc和Caspase-8蛋白的表达分别下降47.16%和32.08%，差异均具有统计学意义(

P

＜0.01)。

图4 PM2.5 染毒HK-2 细胞和p38MAPK 基因沉默细胞后c-myc、Caspase-8和Bcl-2蛋白表达水平

图5 PM2.5染毒两种细胞后部分凋亡相关基因和癌基因的蛋白表达水平变化

3 讨 论

肿瘤细胞的生物学过程是癌症发生的标志，包括增殖、分化、侵袭和迁移。课题组前期研究已经得到PM可以导致肝细胞中癌基因在mRNA或蛋白质水平表达的增加，本次试验结果得到PM染毒后正常HK-2细胞中的

c-myc

和

c-fos

基因相对于未染毒正常HK-2 细胞中表达增加，

p53

基因表达下降，更有力地说明PM可以影响细胞中癌基因的表达。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)被证实是调节肿瘤细胞生物学过程中至关重要的信号通路，MAPK信号通路与卵巢癌、肝癌、人口腔鳞状细胞癌等的发生、发展关系密切。邹寒冰等发现HDW 可能通过抑制MAPK 通路相关蛋白来选择性抑制肾癌细胞ACHN 的增殖，促进ACHN 细胞MET、周期阻滞和凋亡。有研究发现CEM-6T 细胞中p38MAPK 蛋白表达量随PM染毒剂量增加而增加。还有研究利用PM染毒EA.HY926细胞后发现PM可以降低细胞的存活率，上调p38MAPK 蛋白的表达并降低SOD活性。本次研究结果发现，与PM染毒的正常HK-2细胞相比，PM染毒的

p38MAPK

沉默细胞中

c-myc

和

c-fos

基因表达明显下降(

P

＜0.01)，说明

p38MAPK

基因对PM致HK-2细胞中的癌基因活化有一定的抑制作用，国内外学者的研究亦得到当p38MAPK 信号通路激活时c-myc 显著上调。不同于癌基因

c-myc

和

c-fos

的表达，抑癌基因

p53

在PM染毒的

p38MAPK

基因沉默细胞中表达下降，并未表现出

p38MAPK

基因沉默之后对抑癌基因

p53

活化有明显的促进作用，这可能与PM通过激活P53以上调DRAM1 的表达诱导细胞发生自噬有关，提示PM可能也具有导致肾细胞发生自噬的作用。张良等将马兜铃酸 I(aristolochic acid I，AAI)作用于SD雄性大鼠，发现总p38(t-p38)、磷酸化p38(pp38)蛋白、Caspase-3、Caspase-9、Bax等凋亡相关蛋白的表达水平均升高，肾组织中凋亡小体明显增多，AAI 可能通过激活p38MAKP 通路导致肾脏组织细胞凋亡而产生肾毒性效应。在万强等的研究中发现与对照组比较，PM染毒可以上调p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2 蛋白比率以促进细胞凋亡。冯正平等为探讨p38丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)在高糖诱导的MC3T3-E1 成骨细胞凋亡中的作用，对

p38MAPK

基因进行沉默，发现p38MAPK 信号通路的活化受到抑制，p-p38MAPK、Caspase-3、Bax的表达降低，Bcl-2 表达上调，抑制高糖所诱导的MC3T3-E1 成骨细胞的凋亡，说明PM可能通过调节凋亡相关蛋白表达以及调控MAPK信号通路从而影响细胞凋亡。本次实验结果显示，正常细胞经过PM染毒后

Caspase-8

和

Caspase-9

基因的表达水平均上调，

Bcl-2

表达下降，与前述研究结果相一致。与PM染毒的正常HK-2细胞相比，PM染毒的

p38MAPK

沉默细胞中

Caspase-8

和

Caspase-9

基因的表达均明显下降，进一步说明了

p38MAPK

基因对PM染毒致凋亡基因活化具有抑制作用，

Bcl-2

基因则表达增加，说明

p38MAPK

基因也可以对PM染毒致抑凋亡基因活化起一定的促进作用

。

本文分别将正常HK-2细胞染毒前后与

p38MAPK

基因沉默细胞染毒后的癌基因和凋亡相关基因的表达进行比较，发现PM可引起正常HK-2细胞部分癌基因和凋亡相关基因表达水平升高；

p38MAPK

基因沉默细胞经过PM染毒后，癌基因和凋亡基因表达水平较正常细胞染毒后下降，说明

p38MAPK

基因在PM对凋亡相关基因和癌基因的活化过程中有一定的作用。本文建立的

p38MAPK

基因沉默HK-2细胞，为进一步研究MAPK信号通路在PM致细胞损伤作用的机制研究奠定了基础。